Калориметрическое и спектрофотометрическое исследование комплексных липосом содержащих кальций

RUSSIAN JOURNAL OF BIOMECHANICS

На сегодняшний день болезни, связанные с костными тканями, представляют собой большую проблему как в социальном, так и в экономическом аспекте. Чаще всего эти проблемы коррелируют с возрастом человека. Известно, что пожилые люди страдают остеопорозом и остеопенией. Если учесть,

0000-0002-4311-779X

0000-0001-5691-1880

0000-0002-3985-1334

0000-0002-0689-2674

0000-0001-9156-6306

Эта статья доступна в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International

License (CC BY-NC 4.0)

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0)

что за последние десятилетия наблюдается тенденция к увеличению продолжительности жизни населения, то, соответственно, количество таких заболеваний возрастает. Вдобавок лечение заболеваний костных тканей является продолжительным, что влияет как на качество жизни пациента, так и на затраты системы здравоохранения [1–5]. Поэтому актуальной задачей является создание таких препаратов, которые целенаправленно и максимально быстро смогут восполнить дефицит кальция в организме. С другой стороны, известно, что применение кальция в больших дозах не решает эту проблему. Причиной является увеличение концентрации кальция в крови, что вызывает ряд побочных эффектов, например панкреатит, высокое артериальное давление, возникновение камней в почках [6– 8 ]. Также гиперкальциемия препятствует нормальной деполяризации сердечной мышцы что является причиной аритмии и слабости в мышцах. Также повышение кальция в крови вызывает понижение объёма эритроцитов, что в свою очередь, влечет за собой развитие анемии. Гиперкальциемия может привести к увеличению количества красные кровяных клеток, которые способствуют коагуляции крови и возникновению тромбов [2, 9]. Инициатором этого является высокая концентрация кальция в крови [10, 11]. Из вышеперечисленного следует, что для лечения гиперкальциемии человека важно создание таких препаратов, которые, с одной стороны, восполнят дефицит кальция, а с другой стороны, не вызовут возникновения опасных для жизни человека побочных эффектов. Это возможно реализовать при использовании липосом, внутри которых инкорпорирован кальций в больших концентрациях.

Липосомы в основном состоят из двуслойных липидов, состав которых аналогичен составу клеточных мембран, вследствие чего у них хорошая биосовместимость. Благодаря использованию таких липосом возможна целенаправленная доставка ионов кальция в ткани без увеличения концентрации кальция в крови [12, 13]. Именно поэтому наши исследования сфокусированы на создании таких комплексных наночастиц, которые способны в нужных количествах доставить кальций непосредственно в поврежденную кость, избегая негативных эффектов [14–17].

Самые распространенные липосомы состоят из фосфолипидов, которые, в свою очередь, состоят из амфифильных молекул фосфатидилхолина. Для его структуры характерно наличие двух пар гидрофобных ацильных углеводородных цепей, которые с помощью глицерола связываются с полярными гидрофильными головками близлежащих липидов [18–22].

В наших экспериментах использовались дипальмитоилфосфатидилхолин (Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DPPC) и 1-пальмитоил-2-линолеоил-фосфатид (Dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphatidic acid DPPA) фосфолипиды в качестве транспортных средств доставки препарата.

Структура и стабильность кальцийсодержащих комплексных липосом отслеживалась с использованием дифференциального сканирующего микрокалориметра ( DSC ) [26–28].

Методы приготовления DPPA и DPPC липосом

В экспериментах были использованы липосомы, приготовленные с использованием новой технологии [29]. Липосомы готовились из двух типов фосфолипидов . DPPA и DPPC фосфолипиды были поставлены компанией Lipoid ( Newark, NewJersey ) . Для их получения использовалась одна и та же технология [5]. Поскольку для целенаправленной доставки лекарственных средств эффективны наночастицы диаметром 200 нм, были приготовлены липосомы шириной 5 нм и диаметром 200 нм. Было установлено, что для приготовления одной липосомы шириной 5 нм и диаметром 200 нм необходимо 3,3x 10⁴ штук липидов. В представленной работе использовался высокочувствительный дифференциальный сканирующий микрокалориметр DASM -4( DSC ) (Пущино, Россия).

Экспериментальная часть

Калориметрические эксперименты проводились на DPPA и DPPC -липосомах с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды и 20%-ного глицерина как в случае чистых липосом, так и в случае комплексных липосом с инкорпорированным карбонатом кальция. С целью установления термостабильности был выбран температурный интервал в пределах 0°C–100°C и скорость температурного сканирования – 2°C/мин. Калориметрические измерения, проведенные на DPPA- липосомах с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды, показаны на рис. 1, а. С использованием в качестве растворителя 20%-ного глицерина – на рис. 2.

Рис. 1. Зависимость теплоемкости от температуры для DPPA- липосом с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды. Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Рис. 2. Зависимость теплоемкости от температуры для DPPA- липосом с использованием в качестве растворителя 20%-ного глицерина. Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Рис. 3. Зависимость теплоемкости от температуры суспензии DPPA комплексных липосом с инкорпорированным карбонатом кальция с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды. Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Рис. 4. Зависимость теплоемкости от температуры суспензии DPPA комплексных липосом с инкорпорированным карбонатом кальция с использованием в качестве растворителя 20%-ного глицерина. Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Рис. 5. Зависимость теплоемкости от температуры для DPPC- липосом с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды. Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Рис. 6. Зависимость теплоемкости от температуры для DPPC- липосом с использованием в качестве растворителя 20%-ного глицерина.

Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Опираясь на калориметрические измерения, было вычислено количество тепла, выделяемое из DPPA- липосом в результате тепловой денатурации. Оказалось, что для DPPA -липосом, приготовленных с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды, теплота денатурации составляет 21,2 МДж. Что касается DPPA –липосом с использованием в качестве растворителя 20%-ного глицерина, то в этом случае в результате тепловой денатурации выделенное тепло составило 25,3 МДж .

Также эксперименты были проведены на DPPA комплексных липосомах с инкорпорированным карбонатом кальция с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды (рис. 3) и 20%-ного глицерина (рис. 4).

Изучение кривых зависимости теплоемкости от температуры при плавлении DPPA- липосом дает возможность определить структуру липосом. Особое внимание необходимо уделить калориметрическому исследованию DPPA -липосом с инкорпорированным кальцием в 20%-ного глицериновом растворителе. Как показывают калориметрические измерения, чистые DPPA- липосомы, растворенные в 20%-ного глицериновом растворителе, являются многослойными мультиламеллярными структурами, на что указывает существование двух пиков на калориметрических кривых (см. рис. 2). В отличие от чистых DPPA липосом, DPPA комплексные липосомы с инкорпорированным карбонатом кальция имеют только один главный пик плавления, а второй маленький пик исчезает, это указывает, что ионы кальция точно установили связь с DPPA липидами (см. рис. 4).

Основываясь на калориметрических измерениях, было определено количество теплоты, которое выделилось в результате плавления DPPA -липосом, содержащих кальций карбонат, растворенных как в воде, так и в 20%-ного глицерине. Выделенное тепло в обоих случаях оказалось отличным от такового DPPС комплексных липосом. Оказалось, что для DPPA комплексных липосом, содержащих кальция карбонат, приготовленных с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды, теплота денатурации составляет 18,6 МДж, в то время как для DPPA комплексных липосом, содержащих кальция карбонат, при использовании в качестве растворителя 20%-ного глицерина, выделенное тепло составило 13,5 МДж.

Также калориметрические измерения были проведены на DPPC -липосомах с использованием аналогичных растворителей (рис. 5, 6).

С помощью калориметрических измерений было определено то количество тепла, которое выделилось из DPPC-липосом в результате тепловой денатурации. Оказалось, что для DPPC-липосом, приготовленных с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды, теплота денатурации составляет 23,6 МДж. Для DPPC-липосом с использованием в качестве растворителя 20%-ного глицерина количество выделенного теплf составило 25,4 МДж.

Также калориметрические измерения были проведены на DPPC комплексных липосомах с инкорпорированным карбонатом кальция с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды (рис. 7) и 20%-ного глицерина (рис. 8).

Калориметрические эксперименты показали, что, в отличие от DPPA- липосом, DPPC- липосомы, приготовленные как в воде, так и в глицериновом растворителе как в чистом виде, так и при инкорпорировании карбоната кальция, сохраняют мультиламеллярную структуру (см. рис. 5–8).

Основываясь на калориметрических измерениях, было рассчитано количество теплоты, которое выделилось в результате плавления DPPC- липосом, содержащих кальция карбонат, приготовленных как в воде, так и в 20%-ного глицерине. Выделенное тепло в обоих случаях разное. Оказалось, что для DPPC- липосом комплексных, содержащих кальция карбонат, приготовленных с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды, теплота денатурации составляет 15,0 МДж, в то время как для DPPC комплексных липосом, содержащих кальция карбонат, при использовании в качестве растворителя 20%-ного глицерина в результате тепловой денатурации выделенное тепло составило 18,0 МДж.

Факт, что кальций карбонат в действительности образует связи с DPPA и DPPC- липосомами как в воде, так в глицериновом растворителе, кроме калориметрических экспериментов, был подтвержден и на проведенных спектрофотометрических экспериментах. На рис. 9 показаны кривые зависимости поглощения от длины волны для чистых DPPA -липосом и при инкорпорировании ионов кальция.

Спектрофотометрические измерения также проведены на DPPC -липосомах. На рис. 10 показаны кривые зависимости поглощения от длины волны для чистых DPPC -липосом, приготовленных в бидистиллированной воде, и комплексных DPPC -липосом, содержащих ионы кальция.

На спектрофотометрических кривых в случае чистых DPPA и DPPC при длине волны 235 нм наблюдается небольшой пик поглощения, который исчезает при создании кальций содержащих комплексных липосом. Это указывает, что кальция карбонат действительно создал комплексы с липосомами, приготовленными из DPPA и DPPC- липидов.

Рис. 7. Зависимость теплоемкости от температуры суспензии DPPC липосом комплексных с инкорпорированием карбоната кальция с использованием в качестве растворителя бидистиллированной воды. Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Рис. 8. Зависимость теплоемкости от температуры суспензии DPPC липосом комплексных с инкорпорированием карбоната кальция с использованием в качестве растворителя 20%-ного глицерина. Скорость температурного сканирования V =2°С/ min

Рис. 9. Зависимость поглощения от длины волны для суспензии чистых DPPA- липосом и при инкорпорировании ионов кальция.

Растворитель –бидистиллированная вода, а – чистые DPPA- липосомы, б – комплексные DPPA- липосомы, содержащие ионы кальция

Рис. 10. Зависимость поглощения от длины волны для суспензии чистых DPPC- липосом и при инкорпорировании ионов кальция.

Растворитель – бидистиллированная вода:

а – чистые DPPC- липосомы, б – комплексные DPPC- липосомы, содержащие ионы кальция

Обсуждение

Необходимо отметить, что пики поглощения, наблюдаемые на калориметрических записях, являются результатом разрыва водородных связей, существующих между гидрофильными головками фосфолипидов, протекающем при нагреве калориметрической ячейки с образцом. В частности, разрыв связи происходит между группой О=Р–ОН одного фосфолипида и группой С=О другого фосфолипида. Из проведенных нами исследований видно, что в случае чистых липосом, приготовленных из DPPA-липидов плавление упорядоченной структуры происходит на 24°C выше, чем в случае чистых липосом, приготовленных из DPPC липидов (см. рис. 1, 2, 5, 6). Если учесть тот факт, что длина фосфолипидных цепей и состав у DPPC и DPPA одинаковый, ясно, что различие в температуре фазового перехода у этих липидов должно быть обусловлено различием сил взаимодействия, существующих между их головками. Энергия водородных связей между головками DPPA-липидов больше, чем энергия водородных связей между головками DPPC-липидов, так как головки DPPA-липидов меньше по размеру, чем головки DPPC-липидов [4], что дает возможность гидрофильным головкам DPPA-липидов сблизиться друг с другом. Это в свою очередь, обусловливает, что длина водородных связей, существующих между головками DPPA-липидов, меньше, чем длина водородных связей, существующих между головками DPPC-липидов. В то же время сильные водородные связи являются причиной того, что структура чистых DPPA-липосом будет однослойной, то есть униламеллярной, что подтверждается калориметрическими измерениями DPPA-липосом, приготовленных в бидистиллированной воде, в которых пик поглощения является узким (см. рис. 1). Что касается DPPC-липосом, их структура может быть многослойной, то есть мультиламеллярной, при которой возможно возникновение дополнительных новых водородных связей между существующими внутри липосом слоями. Это подтверждается формой калориметрических пиков теплопоглощения, которое в случае DPPC-липосом не является кооперативным, и их главный пик фазового перехода содержит так называемые препики, которые, по нашим соображениям, обусловленым ультиламеллярной структурой DPPC-липосом (см. рис. 5).

В случае DPPC и DPPA -липосом, приготовленных в 20%-ного растворе глицерина, энергия водородных связей сильнее, чем у DPPC и DPPA- липосом, приготовленных в дистиллированной воде, так как глицерин способствует возникновению дополнительных водородных связей между головками и хвостами DPPC и DPPA -липидов. Из-за этих связей они способны образовывать многослойные, мультиламеллярные структуры, и устанавливать связи между соседними слоями.

Калориметрические кривые DPPA- липосом, приготовленных в 20%-ного растворе глицерина, вместо кооперативных становятся некооперативными, и дополнительно возникает небольшой пик в интервале 75°С (см. рис. 2), причиной которого могут быть дополнительные водородные связи, которые глицерин устанавливает с DPPA- липидами. Эти водородные связи являются более сильными, чем водородные связи между самими липидами. Из литературных данных известно, что при добавлении глицерина к DPPC- липидам изменяется угол наклона липидных цепей так, что они располагаются параллельно друг относительно друга [30, 31], что им дает возможность сильнее сблизиться. Поэтому, в отличие от DPPC- липосом, приготовленных в воде, в этом случае возникают более сильные водородные связи, что, в свою очередь, определяет количество тепла, выделенного после термического плавления DPPA- липосом.

Из литературы также известно, что ионы кальция связываются с фосфатными группами во всех типах фосфолипидов [32-37]. Поэтому получается, что кальций конкурирует с фосфолипидами в образовании водородных связей [38, 39]. В присутствии кальция не все фосфолипиды способны образовывать водородные связи, в результате чего выделенное ими количество тепла меньше, чем в случае чистых липосом.

Структура комплексных липосом, содержащих карбонат кальция, приготовленных в глицериновом растворителе, иная, чем структура чистых липосом, приготовленных в глицериновом растворителе, так как кальций конкурирует с теми дополнительными водородными связями, которыми глицерин связывается с DPPC и DPPA-липидами. В результате в полученной структуре количество фосфолипидных слоев уменьшено, как в случае DPPA-липидов, так и в случае DPPC липидов. Это подтверждается калориметрическими экспериментами (см. рис. 4, 8), в соответствии с которыми у кальцийсодержащих комплексных DPPA-липосом, приготовленных в глицериновом растворителе, наблюдается один пик, в отличии от чистых DPPA-липосом, приготовленных в глицериновом растворителе (см. рис. 2). Из выше приведенного можно заключить, что, в отличие от чистых DPPA-липосом, приготовленных в глицериновом растворителе, CaCO 3 - содержащие комплексные DPPA-липосомы, приготовленных в глицериновом растворителе, образуют униламеллярную структуру (см. рис. 4). Что касается CaCO 3 - содержащих комплексных DPPC-липосом, приготовленных в глицериновом растворителе (рис. 8), в отличии от чистых DPPC-липосом, приготовленных в глицериновом растворителе (см. рис. 7), калориметрические эксперименты показывают наличие кроме главного пика только один дополнительный препик. В связи с этим можно предположить, что количество слоев, по сравнению с чистыми липосомами, в случае CaCO3-содержащих комплексных DPPC- липосом меньше.

Кроме калориметрических экспериментов, образование комплексов между липосомами и карбонатом кальция подтверждается спектрофотометрическими исследованиями. Такое заключение можно сделать, наблюдая на спектрофотометрических записях существующий на длине волне 235 нм пик поглощения в случае DPPA и DPPC , чистых липосом, который исчезает у кальцийсодержащих комплексных липосом обоих типов, это указывает, что карбонат кальция действительно установил связи с DPPA и DPPC -липосомами.

Заключение

По форме пика теплопоглощения при плавлении макромолекул возможно судить об упорядоченной структуре макромолекул. Основываясь на полученных экспериментальных результатах, можно определить структуру липосом. В частности, кооперативный и узкий пик фазового перехода плавления липосом указывает, что мы имеем дело с разрывами однотипных связей в структуре липосом под воздействием температуры. В то время как несколько пиков и/или увеличение ширины пика поглощения на полувысоте температурного перехода указывает, что имеем дело с некооперативным процессом. В проведенных экспериментах температурное плавление DPPA- липосом является кооперативным (ширина пика на полувысоте которого 1,8°С), в случае кальцийсодержащих комплексных DPPA-липосом имеется несколько пиков, то есть плавление является не кооперативным. Вышеприведенное дает возможность заключить, что DPPA-липосомы являются одной двуслойной униламеллярной наночастицей. Структура кальцийсодержащий комплексных DPPA-липосом является многослойной, на что указывает тот факт, что количество пиков

Список литературы теплопоглощения увеличевается до двух. Можно заключить, что структура кальцийсодержащих комплексных DPPA и DPPС-липосом является многослойной мультиламеллярной структурой. Мультиламеллярная структура, с другой стороны, дает возможность размещения внутри наночастицы большого количества кальций карбоната. Соответственно, использование таких наночастицах с лечебной точки зрения должно быть эффективным и не имеет побочных эффектов.

No. 3. – P. 39–59.

P. 399–420.

Финансирование Работа финансируется Грузинским научным фондом Шота Руставели в рамках фундаментального гранта FR-21-19898.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов .