Коррекция дисфункции эндотелия - перспективное направление терапии ишемического повреждения почки

строе повреждение почек является важной клинической проблемой, затрагивающей 57% всех госпитализированных пациентов с высоким уровнем смертности и связанными с этим расходами на здравоохранение [1-4]. Ишемия с последующей реперфузией (ИР) является основной причиной острого почечного повреждения [3,5]. ИР почек инициирует изменения в почечном кровотоке, сосудистых эндотелиальных клетках, эпителиальных клетках почечных канальцев и лейкоцитах с гибелью клеток и истощением запасов АТФ, которые приводят к нарушению функции почек. Одним из ранних событий в ИР почек является повреждение эндотелия, что приводит к нарушению функционального состояния сосудов [6].

Таким образом, поиск инновационных молекул, влияющих на функциональное состояние эндотелия является одной из терапевтических стратегий нефропротекции для предупреждения развития острого почечного повреждения.

Целью нашего исследования явилось изучение возможности профилактики ишемически-реперфузион-ных повреждений почек селективным ингибитором аргиназы II – KUD975.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г в соответствии с требованиями ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практи-ки», с соблюдением «Euro-pean Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No. 123». Все крысы были разделены на следующие экспериментальные группы, по 10 животных в каждой:

• I    – ложнооперированные (л/о) (24 часа);

• II    – ложнооперированные (72 часа);

• III    – контрольная, моделирование 40-минутной ишемии-реперфузии почек (24 часа реперфузии);

• IV – контрольная, моделирование 40-минутной ИР почек (72 часа реперфузии);

V – профилактическое однократное внутрижелудочное введение селективного ингибитора аргиназы II – KUD975 в дозе 1 мг/кг за 120 минут до моделирования патологии (24 часа реперфузии);

VI – профилактическое однократное внутрижелудочное введение селективного ингибитора аргиназы

II – KUD975 в дозе 1 мг/кг за 120 минут до моделирования патологии (72 часа реперфузии);

VII – профилактическое однократное внутрижелудочное введение селективного ингибитора аргиназы II – KUD975 в дозе 3 мг/кг за 120 минут до моделирования патологии (24 часа реперфузии);

VIII – профилактическое однократное внутрижелудочное введение селективного ингибитора аргиназы II – KUD975 в дозе 3 мг/кг за 120 минут до моделирования патологии (72 часа реперфузии);

• IX    – профилактическое однократное внутрибрюшинное введение L-норвалина в дозе 100 мг/кг однократно за 30 минут до моделирования патологии (24 часа реперфузии);

• X    – профилактическое однократное внутрибрюшинное введение L-норвалина в дозе 100 мг/кг однократно за 30 минут до моделирования патологии (72 часа реперфузии);

Моделирование ишемии-реперфузии почек

Под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг) выполнялась срединная лапаротомия. Петли кишечника отодвигали в сторону и с разницей в 5 минут производили наложение атравматичных сосудистых зажимов на почечные ножки на 40 минут. Ложноопериро-

Рис. 1. Динамика сывороточной концентрации креатинина в экспериментальных группах Примечание: x – р <0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; y – р <0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии

Рис. 2. Динамика сывороточной концентрации мочевины в экспериментальных группах Примечание: x – р <0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; y – р <0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии

Рис. 3. Динамика скорости клубочковой фильтрации в экспериментальных группах Примечание: x – р <0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; y – р <0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии

Рис. 4. Динамика фракционной экскреции натрия в экспериментальных группах Примечание: x – р <0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; y – р <0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии

ванные животные не подвергались двусторонней ишемии почек, им в брюшную полость вводился 0,9% раствор натрия хлорида (4-5 мл) и рана послойно ушивалась.

Измерение уровня микроциркуляции

Уровень микроциркуляции измеряли через 5 минут, 24 или 72 часа реперфузии в зависимости от экспериментальной группы, выражая значения в перфузионных единицах (ПЕ) и осуществляли с помощью аппаратно-программного комплекса MP100 (Biopac System, Inc., США) с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и поверхностного датчика TSD143. Регистрация и обработка результатов производилась с помощью программного обеспечения AcqKnowl-edge версии 3.8.1.

Измерение концентрации креатинина, мочевины, натрия

В группах I, III, V, VII и IX сбор мочи осуществляли в метаболических клетках во временном промежутке 12 - 24 часа после окончания ишемии. В группах II, IV, VI, VIII и X сбор мочи осуществляли в метаболических клетках во временном промежутке 48- 72 часа после окончания ишемии. Далее под наркозом производили релапаротомию и отбирали кровь из правого желудочка для биохимических исследований. Измерялся суточный диурез.

Концентрацию уровня креатинина, мочевины и натрия в сыворотке крови и моче измеряли по общепринятой методике.

Расчет скорости клубочковой фильтрации и фракционной экскреции натрия

Клиренс эндогенного креатинина (скорость клубочковой фильтрации (СКФ) рассчитывался следующим образом:

СКФ=

креатинин мочи(мкмоль/л)×объем мочи (мл)

креатинин сыворотки крови (мкмоль/л )×время (мин)

Фракционная экскреция натрия (ФЭН) рассчитывалась по следующей формуле:

_ФЭН= натрий мочи ×креатинин сыворотки крови _×100% натрий сыворотки крови ×креатинин мочи

Статистическая обработка данных

Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее зна-

Таблица 1. Динамика уровня микроциркуляции при введении изучаемых веществ (М±m; n=10)

Экспериментальная группа

Ложнооперированные

Ишемия-реперфузия

Ишемия-реперфузия + L-норвалин         437,9±29,1x,y  657,9±18,8x,y  441,4±11,6x,y

Ишемия-реперфузия + KUD975 1 мг/кг     431,1±32,9 x,y  691,8±23,5x,y  485±16,4x,y

Ишемия-реперфузия + KUD975 3 мг/кг     604,7±43,5 x,y  718,2±44,5x,y  653,6±62,0x,y

Примечание: x – р <0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных; y – р <0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии

чение (M) и стандартная ошибка среднего (m). Межгрупповые различия анализировались параметрическими (t-критерий Стьюдента) или непараметрическими (критерий Манна-Уитни) методами, в зависимости от типа распределения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Моделирование ишемии-реперфузии почек приводило к росту креатинина и мочевины (рис. 1,2). Параллельно росту креатинина падала скорость клубочковой фильтрации, уровень которой к третьим суткам составлял лишь 0,06±0,01 мл/мин (рис. 3). Канальцевые повреждения также нарастали от первых к третьим суткам эксперимента, что выражалось в значительном росте фракционной экскреции натрия (рис. 4). Микроциркуляторные нарушения также отмечались во всех временных точках эксперимента (табл. 1).

5 минут 24 часа 72 часа

904,5±60,4    870,5±98     859±68,0

209±24,4 x   418,1±46,0x   315,5±13,8x экспериментальная и клиническая урология № 1 2 0 19

Профилактическое введение селективного ингибитора аргиназы II на фоне моделирования ишемии-реперфузии почек приводило к значимому росту СКФ до 0,24±0,02 мл/мин и 0,31±0,02 мл/мин через 24 часа реперфузии в дозах 1 мг/кг и 3 мг/кг, соответственно. Неселективный ингибитор аргиназ L-норвалин оказывал менее выраженное влияние на СКФ, восстанавливая данный показатель до 0,21±0,02 мл/мин (рис. 3).

На 3-и сутки эксперимента также отмечалось дозозависимое улучшение фильтрационной способности почек, выражающееся в снижении концентрации сывороточного креатинина до 81,3±2,8 мкмоль/л и 73,7±2,22 мкмоль/л и восстановлении СКФ до 0,22±0,02 мл/мин и 0,26±0,0 мл/мин на фоне применения KUD975 в дозах 1 мг/кг и 3 мг/кг соответственно (рис. 1, 3).

Сывороточные значения концентрации мочевины подчинялись тем же закономерностям, что и сывороточная концентрация креатинина: снижались под действием KUD975 как на первые, так и третьи сутки эксперимента. Неселективный ингибитор аргиназы II оказывал менее выраженный эффект, причем фармакологическая коррекция L-норвалином на 3 сутки эксперимента не позволила достигнуть значений, достоверно отличающихся от группы ишемии-реперфузии (рис. 2).

На фоне применения KUD975 в дозах 1 мг/кг и 3 мг/кг отмечалось улучшение функционального состояния почечных канальцев, регистрируемое по снижению ФЭН которая была выражена в большей степени на 3-и сутки эксперимента и составляла 2,27±0,17% и 1,8±0,09% соответственно (рис. 4).

Однократное профилактическое применение селективного ингибитора аргиназы II KUD975 в дозах 1 мг/кг и 3 мг/кг за 120 минут до начала ишемии приводило к восстановлению уровня микроциркуляции во всех временных точках эксперимента, превосходя статистически достоверно показатели группы с применением неселективного ингибитора аргиназы II L-норвалина (p<0,05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ