Коррекция нарушений метаболизма суставного хряща и морфологическая оценка эффективности внутрисуставной озонотерапии при экспериментальном посттравматическом артрите

В настоящее время проблема травматических повреждений крупных суставов является актуальной, несмотря на разнообразие современных методов лечения [5–6]. Обеспокоенность данной проблемой объясняется тем, что в отдаленные сроки после травм суставов у 92 % больных имеется рентгенологическая картина деформирующего остеоартроза, приводяще- го к стойкой утрате нетрудоспособности [7–8].

В состав гиалинового хряща входят клетки – хондроциты и хондробласты, а также межклеточное вещество, которое представлено белково-поли-сахаридными комплексами и коллагеновыми волокнами [2; 9–12]. Известно, что травматическое повреждение сустава, сопровождающееся кровоизлиянием в его полость, в ранние сро- ки приводит к возникновению внутри-и внесуставных изменений и в первую очередь – развитию синовита. Хро-низация экссудативного процесса является одной из основных причин формирования вторичных пролиферативных и дегенеративно-дистрофических изменений [6; 11; 13].

Воспалительный процесс в суставе приводит к дисбалансу между катаболическими и анаболическими реакциями, протекающими в хрящевой ткани, в сторону увеличения активности распада коллагена и протеогликанов межклеточного матрикса. Их фрагменты попадают в синовиальную жидкость и усиливают воспалительную реакцию, в условиях которой наблюдается нарушение белоксин-тезирующей функции хондроцитов, в результате чего ими образуется короткоцепочечный нефибриллярный коллаген [14–15]. Оксипролин является специфической аминокислотой коллагена, поэтому может использоваться в качестве маркера его метаболизма [10; 16–19].

При развитии посттравматического артрита (ПА) наблюдается увеличение содержания оксипролина в сыворотке крови за счет его свободной (СО) и пептидосвязанной (ПСО) фракции [9; 20–21]. Синтез коллагена, напротив, характеризуется увеличением фракции белковосвязанного оксипролина (БСО). В настоящее время важную роль в патогенезе посттравматического остеоартроза отводится активации процессов перекисного окисления липидов, продукты которых усугубляют деструкцию хондроцитов и межклеточного матрикса суставного хряща [3–4; 22–23]. При этом патогенетически обоснованный подход к профилактике посттравматического остеоартроза в настоящее время отсутствует.

Учитывая механизмы развития острого асептического ПА, наиболее целесообразным в комплексном лечении является применение локаль- ной внутрисуставной озонотерапии, поскольку озон обладает широким спектром воздействия: анальгетическим, противовоспалительным, иммуномодулирующим; улучшает микроциркуляцию, оптимизирует про- и антиоксидантные системы, потенцируя действие других лекарственных препаратов [5; 16].

Цель исследования – изучить влияние внутрисуставной озонотера-пии на некоторые показатели обмена коллагена и морфологические изменения тканей сустава при экспериментальном ПА.

Материалы и методы

Эксперименты были проведены на 132 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180–200 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва». Протокол экспериментов был составлен в соответствии с Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (принятой Советом Европы в 1986 г.), с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики»; он соответствует требованиям Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (2000 г.), одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва».

Животные были разделены на 5 групп. Первую серию составили интактные животные в количестве 12 крыс. В контрольной (30 животных) и опытных группах под ингаляционным наркозом моделировали повреждение коленного сустава механическим путем в модификации Г. М. Дубровина [2]. Во II контрольной группе лечение не проводилось. Животным III группы (30 крыс), начиная со дня моделирования травмы, проводился курс лечения нимесулидом через зонд в среднетерапевтической дозе 2 мг/кг ежедневно в течение 10 дней. В IV группе (30 животных) проводилось внутрисуставное введение озоно-кислородной смеси в концентрации озона на выходе из аппарата 15 мг/л через день в количестве 5 сеансов. На животных V группы (30 крыс) изучалось комбинированное влияние нимули-да в дозе 2 мг/кг и внутрисуставного введения озоно-кислородной смеси в концентации 15 мг/л по указанной выше схеме введения. Для исследования от животных получали периферическую кровь и поврежденные коленные (скакательные) суставы конечностей.

Оценку метаболизма коллагена проводили по содержанию СО, ПСО и БСО в сыворотке крови по методу П. Н. Шараева [24] (на данную методику оценки интенсивности деструктивных процессов в суставе нами был получен патент № 2463000 от 10.10.2012 г.). Гистологическим методом изучали морфологию суставного хряща, синовиальной оболочки и субхондрального слоя костной ткани. Серийные срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Исследование было проведено с использованием светового биологического микроскопа «Humascope Advanced Led» (Германия).

Животных выводили из эксперимента на 28-е сутки. Статистическая обработка результатов исследований была проведена с помощью t-критерия Стьюдента. Изменения считали достоверными при р < 0,05 (0,01; 0,001).

Результаты исследования

При исследовании сыворотки крови животных контрольной группы после моделирования травмы коленного сустава относительно интактной серии выявлено увеличение содержания

СО и БСО на 188,9 % и на 135,1 % соответственно; содержание ПСО выросло в 2,76 раза; коэффициент ПСО/ СО повышался и составил 1,38 ± 0,15 усл. ед. (p < 0,001).

На фоне внутрижелудочной нестероидной противовоспалительной терапии нимесулидом содержание СО в сыворотке крови было снижено на 20,5 %; ПСО – на 47,8 %; БСО – на 26,8 % по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группы (p1 < 0,001). Коэффициент ПСО/СО был равен 0,91 ± 0,09 усл. ед.

При внутрисуставном введении газообразной озоно-кислородной смеси относительно данных контрольной серии наблюдалось снижение фракций оксипролина: уровень СО – на 25,0; концентрация ПСО – на 59,0%; БСО – на 39,4 % (p1 < 0,001). Коэффициент ПСО/СО составил 0,76 ± 0,05 усл. ед.

При комбинированном применении нестероидной противовоспалительной терапии нимесулидом и внутрисуставной озонотерапии фракции оксипролина в сыворотке крови по сравнению с данными контрольной серии изменились следующим образом: СО снизился на 35,1%; ПСО – на 66,4 %; БСО – на 47,8 %; коэффициент ПСО/СО – на 47,8 % (p1 < 0,001) (таблица).

При макроскопической оценке гиалиновый хрящ коленного сустава интактных животных имел беловаторозовую окраску, гладкую, блестящую поверхность и упругую структуру. Микроскопически гиалиновый хрящ эпифиза бедренной кости крысы имел сходство с человеческим, в нем выделялись 3 зоны: поверхностная, средняя (промежуточная) и глубокая.

Т а б л и ц а

T a b l e

Динамика некоторых показателей обмена коллагена при экспериментальном посттравматическом артрите на фоне комбинированного применения нимесулида и озона, 28-е сутки (M ± m)

Dynamics of some indicators of collagen metabolism in experimental post-traumatic arthritis by combination of nimesulide and ozone, 28 day (M ± m)

Показатель / Index	Интактные животные (n = 12) / Intact animals (n = 12)	Контрольная группа (n = 30) / Control group (n = 30)	НПВС (n = 30) / NSAID (n = 30)	В/с озон (n = 30) / Ozone (n = 30)	НПВС + в/с озон (n = 30) / NSAID + ozone (n = 30)
СО, мкмоль/л / FO, mmole/l	13,74 ± 0,51	28,31 ± 0,94 (p < 0,001)	22,51 ± 0,52 (p < 0,001; p1< 0,001)	21,23 ± 0,45 (p < 0,001; p1< 0,001)	21,23 ± 0,45 (p < 0,001; p1< 0,001)
ПСО, мкмоль/л / PBO, mmole/l	7,42 ± 0,42	39,36 ± 1,43 (p < 0,001)	20,53 ± 1,07 (p < 0,001; p1< 0,001)	16,13 ± 1,22 (p < 0,001; p1< 0,01)	16,13 ± 1,22 (p < 0,001; p1< 0,01)
БСО, мкмоль/л / PBH, mmole/l	51,26 ± 0,89	123,93 ± 1,89 (p < 0,001)	91,76 ± 1,20 (p < 0,001; p1< 0,001)	75,19 ± 1,13 (p < 0,001; p1< 0,001)	75,19 ± 1,13 (p < 0,001; p1< 0,001)
ПСО/СО, усл. ед. / PBO/FO, mmole/l	0,54 ± 0,02	1,38 ± 0,15 (p < 0,001)	0,91 ± 0,09 (p < 0,01; p < 0,05)	0,76 ± 0,05 (p < 0,001; p < 0,001)	0,76 ± 0,05 (p < 0,001; p < 0,001)

Примечания: p – достоверность отличий к данным интактных животных; р1 – достоверность отличий к данным контрольной группы / Note: p – reliatibility of differences in the data intact animals; р1 – significance of differences in the control group

При визуальной оценке у крыс контрольной серии в области коленного сустава наблюдался отек, стойкая сгибательная контрактура; при передвижении животные хромали и щадили травмированную конечность. Макроскопическое исследование суставной поверхности бедренной кости выявило в области медиального мыщелка дефект в виде углубления с нечеткими границами. Поверхность хряща имела желтовато-белую окраску без характерного блеска.

При световой микроскопии определялось нарушение цитоархитектоники хрящевой ткани, распространяющееся далеко от экспериментально нанесенной травмы. Отмечалось разволокнение поверхностной зоны и образо- вание узур, уменьшение количества клеточных элементов в лакунах и их дегенеративные изменения. В субхондральной кости обнаруживались признаки остеосклероза. Толщина суставного хряща была значительно ниже, чем у интактных животных, с одновременным сокращением численной плотности функционально активных хондроцитов, что способствовало дезорганизации коллагеновых фибрилл и формированию фиброзного хряща (рис. 1).

Деструктивно-дистрофические изменения обнаруживались также в синовиальной оболочке: атрофия и фиброз стромы, склероз сосудов микроцирку-ляторного русла и очаговая инфильтрация лейкоцитами.

Р и с. 1. Гистологический препарат. Суставной хрящ коленного сустава крысы. Группа контрольная. (Посттравматический артрит). Увеличение 10х40. Окраска гематоксилином и эозином.

F i g 1. Histological preparation. Articular cartilage of rat knee joint. Group control. (Post-traumatic arthritis). Increased 10x40. Hematoxylin and eosin stain.

Суставы животных, получавших нимесулид, внешне были в удовлетворительном состоянии. Макроскопическое исследование выявило, что хрящ был тусклым, имел желтоватую окраску с участком организации в области травматического повреждения. При световой микроскопии были определены уменьшение количества хондроцитов поверхностной зоны, а также деструктивные изменения части клеточных элементов, деструкция межклеточного матрикса с образованием узур.

Аналогичные изменения наблюдались также в более глубоких слоях хрящевой ткани вплоть до субхондральной кости, где определялись признаки остеосклероза. Нарушение цитоархитектоники распространялось за пределы экспериментальной травмы. С морфологической точки зрения, в синовиальной оболочке была обнаружена картина хронического посттравматического синовита – фиброз, умеренная лимфоцитарная инфильтрация стромы и реактивные изменения синовиальных клеток.

У животных, получавших озон внутрисуставным способом введения, внешний вид сустава мало отличался от здорового. Макроскопически суставной хрящ имел свойственные ему цвет и блеск, область дефекта была покрыта соединительнотканным регенератом. Деструктивные изменения хряща ограничивались незначительным числом трещин поверхностной зоны в смежных с дефектом областях. Склеротические изменения субхондральной кости затрагивали отдельные трабекулы в зоне повреждения. Морфологическая структура синовиальной оболочки характеризовалась незначительной степенью воспаления в виде периваскулярной лейкоцитарной инфильтрации.

Наиболее выраженная регрессия морфологических изменений по сравнению с контрольными данными наблюдалась при комбинации перорального применения нимесулида и внутри- суставного введения озона. Отека в области коленного сустава не наблюдалось. Макроскопически участок хряща, соответствующий экспериментальной травме, отличался от другой локализации небольшим углублением и отсутствием типичного блеска. При гистологическом исследовании было выявлено, что сам дефект заполнен зрелой соединительной тканью, в которой определялось большое количество хондроцитов. Зональность структуры хрящевой ткани вне очага повреждения четко прослеживалась. Фибрилляции поверхностной и промежуточной зоны не наблюдалось. При исследовании субхондральной кости деструкции и склероза костных балок обнаружено не было (рис. 4). В синовиальной оболочке при морфологическом изучении редкой находкой были периваскулярные инфильтраты.

Р и с. 2. Гистологический препарат. Суставной хрящ коленного сустава крысы (Посттравматический артрит). Группа с комбинированным применением нимесулида и внутрисуставным введением озона. Увеличение 10х40. Окраска гематоксилином и эозином.

F i g 2. Histological preparation. Articular cartilage of rat knee joint (Post-traumatic arthritis). Group with the combined use of nimesulide and intra-articular injection of ozone. Increased 10x40. Hematoxylin and eosin stain.

Обсуждение и заключения

Моделирование ПА коленного сустава приводит к дисбалансу метаболизма коллагена, характеризующегося значительным ростом всех фракций оксипролина, свидетельствующем о деструктивных процессах коллагена с одновременной высокой активностью неполноценного фибриллогенеза, приводящего к избыточному накоплению соединительной ткани с развитием склерозирования хряща и субхондральной кости.

Нестероидная противовоспалительная терапия, уменьшая воспаление, препятствовала деградации биополимеров соединительной ткани сустава, однако не ограничивала избыточные процессы фибриллогенеза, о чем свидетельствует высокий уровень БСО сыворотки на поздних стадиях экспериментального ПА.

Комбинированное применение ни-месулида и внутрисуставной озонотера-пии при травматическом повреждении коленного сустава в большей степени способствует уменьшению альтерации коллагеновых элементов экстрацеллюлярного матрикса хряща и коррекции синтетических процессов в обмене коллагена (снижение БСО и ПСО/СО), в отличие от лечения нимесулидом и внутрисуставного введения озоно-кислородной смеси в качестве монотерапии.

Данный эффект обусловлен воздействием препаратов на различные звенья патогенеза ПА: с одной стороны, нимесулид подавляет хемотаксис нейтрофилов и макрофагов в очаг воспаления, снижая синтез простагландинов и провоспалительных цитокинов. С другой, озон устраняет тканевую гипоксию, оказывает иммуномодулирующий, противовоспалительный эффект, модифицирующее действие на структурно-функциональное состояние клеточных мембран, усиливая метаболические процессы в клетках. Это пре- дупреждает избыточный фибриллогенез и склерозирование тканей сустава.

Выявленные данные обосновывают комбинированное применение нестероидной противовоспалительной терапии и внутрисуставной озоноте-рапии, позволяющее в ранние сроки купировать воспалительный процесс в пораженном суставе, стимулировать заживление травматического дефекта и уменьшить развитие дегенеративнодистрофических процессов.

Полученные результаты обусловливают необходимость дальнейшего проведения углубленных доклинических исследований и планирования клинических испытаний эффективности комбинированного применения нимесулида и внутрисуставной озо-нотерапии у больных с травматическими повреждениями коленного сустава с целью предупреждения прогрессирования ПА.