Коррекция паттернов агрессивного поведения модулированными ex vivo иммунокомпетентными клетками: экспериментальное исследование

Современное развитие нейронаук вплотную подошло к представлению о зависимости биопси-хосоциального поведения индивидуума и его персонологических характеристик от непосредственного взаимодействия иммунологической и психологической реактивности организма, оцениваемых с позиций психофизиологической целостности высокоорганизованных систем. На сегодняшний день уже не остается сомнений в том, что основные гомеостатические системы организма ‒ нервная и иммунная ‒ тесно взаимодействуют в процессе своего функционирования на всех этапах онтогенеза. Установлены основные каналы и механизмы указанной интеграции, определена роль конкретных мессенджеров, обеспечивающих психонейроиммунное взаимодействие [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Клинические наблюдения и экспериментальные исследования свидетельствуют о существовании тесной связи иммунологической реактивности человека и животных с особенностями их поведения. Кроме того, продолжается активное исследование роли нарушений нейроиммун-ного взаимодействия в развитии поведенческих расстройств, которое оказывает негативное влияние на ход заболевания, утяжеляя клиническую картину и снижая эффективность терапии [1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10]. Аффективное состояние агрессии является серьезной медико-биологической проблемой, обусловленной высоким процентом больных и отсутствием избирательных корректирующих средств.

Наиболее часто повышение агрессивности встречается у больных депрессивными расстройствами, шизофренией, реактивными психозами и расстройствами адаптации, которые, как известно, характеризуются иммунологической дисфункцией, включая изменение функционального фенотипа иммунокомпетентных клеток (ИКК) [1, 4, 7, 8, 9, 10]. Актуальность проблемы определяется возрастающими отрицательными параметрами среды обитания: во всем мире возрастает значимость негативных последствий влияния стрессогенных факторов (стихийные бедствия, техногенные катастрофы и военные столкновения, в которые вовлекается все большее количество пострадавших). Воздействие психогений может приводить к срыву социально-биологических механизмов адаптации организма и, как следствие, к формированию нарушений в психоэмоциональной сфере, проявляющихся, в частности, в виде различных поведенческих расстройств, включая агрессию. В связи с чем коррекция поведенческих расстройств, а именно агрессивного поведения, является важной медицинской и социальной проблемой. Психоактивные препараты, применяемые с этой целью, достаточно эффективны, их действие в том числе проявляется в достижении седативного эффекта. Однако они обладают рядом негативных побочных эффектов, такие как возникновение привыкания, зависимости, эндокринные нарушения, а также возможность индуцирования поздних психозов (психозов дофаминовой сверхчувствительности), возникающих при длительном приеме указанных препаратов, что утяжеляет течение основного расстройства и ограничивает возможности их длительного использования. Помимо того, повышается количество пациентов, резистентных к стандартной терапии.

Одним из способов решения этой проблемы является разработка новых методов лечения, основанных на иммунологических подходах. Однонаправленное влияние большинства психоактивных препаратов на клетки ЦНС и иммунной системы позволяет рассматривать ИКК в качестве модельных объектов для воздействия на межсистемную функциональную взаимосвязь для коррекции поведенческих расстройств.

В лаборатории нейроиммунологии НИИФКИ впервые была установлена возможность и определены основные механизмы направленного формирования/изменения паттернов поведения экспериментальных животных трансплантацией ИКК с определенными функциональными характеристиками [5, 11, 12, 13, 14, 15], а также представлены возможность и механизмы коррекции депрессивно-подобного поведения путем трансплантации модулированных кофеином ИКК [5, 16].

Способность лимфоцитов после адоптивного переноса модулировать поведение и когнитивные функции, в том числе и путем непосредственного контакта с клетками ЦНС, впоследствии обсуждалась и другими исследователями [17, 18], что определяет перспективность данного подхода.

Исследование влияния ИКК, модулированных ex vivo психоактивным веществом, на паттерны поведения у агрессивных животных.

Исследование выполнено на мышах-самцах (CBAxC57BL/6)F1 4-месячного возраста весом 22-25 граммов, полученных из питомника НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН (г. Томск). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей в каждой, на стандартной диете, при нормальном световом режиме. Содержание экспериментальных животных соответствовало правилам, принятым Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), и правилам лабораторной практики (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003 г.).

Учитывая наличие в популяции половозрелых самцов (CBA×C57BL/6)F1 особей с активным и пассивным типами поведения, со свойственными им определенными структурными и функциональными характеристиками нервной и иммунной систем и различными психофизиологическими реакциями на стрессовые воздействия [5, 19, 20], для формирования однородных экспериментальных групп всем мышам был предварительно проведен тест Открытое поле. В эксперимент были включены только животные с активным типом поведения, которое формировалось в результате многократного опыта побед в ежедневных меж-самцовых конфронтациях с подчиненным партнером (модель хронического социального конфликта) [21]. Анализ поведения агрессивных самцов в условиях модели сенсорного контакта показал, что в целом состояние, формируемое у самцов под влиянием повторного опыта агрессии, удовлетворяет формальным критериям, которые приводятся в литературе для обозначения обученной агрессии у людей. Выявляется сходство механизмов нейрохимии и фармакологии агрессии у людей и животных, сходство стимулов и условий, вызывающих формирование обученной агрессии, сходство эмоциональных состояний, что обусловливает релевантность используемой модели [22]. Агрессивные самцы (CBA×C57BL/6)F1 использовались в последующих экспериментах в качестве доноров и реципиентов ИКК.

Прекультивированные с аминазином ИКК агрессивных доноров вводили сингенным агрессивным реципиентам в ретроорбитальный синус (15×106 клеток в 0,3 мл физиологического раствора на животное). В контрольной группе агрессивных мышей-реципиентов подготовка и трансплантация ИКК были проведены в аналогичных условиях, за исключением того, что прекультивирование спленоцитов проводилось без аминазина.

Поведенческое фенотипирование мышей-реципиентов опытной и контрольной групп включало исследование агрессивного поведения (тест Агонистическое взаимодействие), уровня агрессивной мотивации (тест Перегородка), ориентировочно-исследовательского поведения (тест Открытое поле), уровня тревожности (тест Приподнятый крестообразный лабиринт). Исследование с использованием поведенческого тестирования проводилось в интервале с 10 до 15 часов. Поведение мышей-реципиентов опытной и контрольной групп исследовали в последовательном режиме (допускалось выполнение одного теста в день). В периоды между тестированием мышей содержали в индивидуальных клетках для исключения агонистических взаимодействий. Поведение животных регистрировали с помощью боковой и верхней цифровых камер видеонаблюдения, а обработку и анализ видеозаписей проводили с помощью программного обеспечения EthoVision XT (Noldus, Netherlands). Арены тестовых установок очищали 20% раствором этанола и тщательно высушивали перед каждым сеансом тестирования.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с применением парного U-критерия Манна-Уитни (компьютерная программа STATISTICA 10.0 for Windows, StatSoft, USA). Данные представлены в виде М±SD. Различия считали достоверными при p<0,05.

Показано, что после обработки in vitro аминазином спленоциты агрессивных мышей характеризуются сниженной митоген-индуцированной пролиферативной активностью (рис. 1).

Р и с у н о к 1. Пролиферативная активность (имп/мин) обработанных in vitro аминазином спленоцитов агрессивных мышей (CBAx C57BL/6)F1

Примечание. Контроль – спленоциты, прекультивированные без аминазина; опыт – спленоциты, прекультиви-рованные с аминазином. 1 – спонтанная пролиферативная активность; 2 – КонА-индуцированная пролиферативная активность; 3 – ЛПС – стимулированная пролиферативная активность; различия между контрольной и опытной группами клеток: * ‒ p<0,05; ** ‒ p<0,01 (критерий Манна-Уитни).

Цитокины, являясь не только иммунорегуляторами, но и нейромодуляторами, а также обладая выраженными психо- и нейротропными свойствами, вовлекаются в механизмы формирования агрессивного поведения, индуцированного социальным стрессом [23, 24, 25]. Продемонстрировано, что агрессивные мыши характеризуются более высоким, чем у особей без социальных конфронтаций, уровнем спонтанной продукции клет- ками селезенки цитокинов ИНФ-y, ИЛ-2 и ИЛ-10, стимулированной митогенами продукции ИНФ-y, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10 при сниженной продукции ФНО-а [23]. По результатам данного исследования установлено, что прекультивирован-ные с аминазином спленоциты агрессивных мышей (CBAxC57BL/6)F1 отличаются сниженной митоген-стимулированной продукцией цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6 и ИНФ-y (рис. 2).

□ Контроль ■ Опыт

Рисунок 2. Продукция цитокинов (пг/мл) спленоцитами агрессивных мышей (CBAxC57Bl/6)F1 после обработки клеток in vitro аминазином

Примечание. Контроль - спленоциты, прекультивированные без аминазина; опыт - спленоциты, прекультивированные с аминазином. Различия между контрольной и опытной группами клеток: * - p<0,05; ** - p<0,01 (критерий Манна-Уитни).

Следовательно, прекультивирование с аминазином спленоцитов агрессивных мышей вызывает модуляцию функциональной активности указанных клеток, что проявляется в снижении стимулированной митогенами пролиферативной активности и продукции ряда цитокинов.

При оценке паттернов поведения агрессивных реципиентов (CBAxC57BL/6)F1 после трансплан- тации сингенных спленоцитов, ex vivo модулированных аминазином, при проведении теста Перегородка выявлено уменьшение уровня агрессивной мотивации, о чем свидетельствует снижение количества подходов к перегородке (p<0,05) и времени, проведенного рядом с перегородкой в клетке (p<0,01), по сравнению с контрольной группой мышей-реципиентов (рис. 3).

□ Контроль Юпыт

Рисунок 3. Агрессивная мотивация сингенных реципиентов (CBAxC57Bl/6)F1 после трансплантации спленоцитов, обработанных in vitro аминазином

Примечание. Контроль - агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, прекульти-вированных без аминазина; опыт - агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, пре-культивированных с аминазином (n=13-14 в каждой группе). Различия между контрольной и опытной группами реципиентов: * -p<0,05; ** - p<0,01 (критерий Манна-Уитни).

Анализ результатов, полученных при выполнении теста Агонистические взаимодействия, выявил у большинства агрессивных мышей-реципиентов после трансплантации модулированных аминазином ИКК снижение уровня агрессии по сравнению с таковым в контрольной группе. Это подтверждается уменьшением общего времени (p<0,05) и числа атак (p<0,05) с увеличением латентного периода до первой атаки (p<0,01), снижением числа угроз (p<0,01) при более длительном латентном времени враждебного поведения (p<0,01), повышением времени обнюхиваний (p<0,05) и уменьшением количество вращений (p<0,05) (рис. 4).

Атаки

Агрессивный груминг

□ Контроль НОпыт

□ Контроль ИОпыт

Разбрасывание чужой подстилки

Непрямая агрессия

□ Контроль ИОпыт

Рисунок 4. Уровень агрессивности сингенных реципиентов (CBAxC57Bl/6)F1 после трансплантации спленоцитов, обработанных in vitro аминазином

Примечание. Контроль - агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, прекульти-вированных без аминазина; опыт - агрессивные реципиенты после трансплантации сингенных спленоцитов, пре-культивированных с аминазином (n=13-14 в каждой группе). Различия между контрольной и опытной группами реципиентов: * - p<0,05; ** - p<0,01 (критерий Манна-Уитни).

Вместе с тем у агрессивных мышей-реципиентов обнаружено снижение еще двух показателей: тревожности - при проведении теста Приподнятый крестообразный лабиринт и эмоциональной реактивности - при выполнении теста Открытое поле, зарегистрированное по количеству фекальных болюсов (4,38±1,37 и 2,72±1,56 в контрольной и опытной группах соответственно, p<0,05), что косвенно свидетельствует об анксиолитическом эффекте введенных ИКК.

Одновременно с этим зарегистрировано изменение параметров ориентировочно-исследовательского поведения агрессивных мышей-реципиентов, что подтверждается снижением двух параметров активности: моторного компонента поведения (показатели горизонтальной двигательной активности); исследовательского компонента поведения (показатели вертикальной двигательной активности в тесте Открытое поле) на фоне снижения нейровоспаления. Эти результаты совпадают с ранее представленными доказательствами об изменении содержания ряда цитокинов в патогенетически значимых для агрессии структурах головного мозга, таких как гипоталамус, гиппокамп, стриатум и фронтальная кора, в сторону снижения провоспалительных цитокинов ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-6, ИНФ-y и повышения противовоспалительного ИЛ-4 [26].

Участие цитокинов в механизмах регуляции агрессии показано на модели формирования агрессивного поведения в виде корреляционной взаимосвязи с изменениями продукции цитокинов периферическими ИКК и цитокинового профиля в вышеуказанных структурах мозга, где при формировании агрессивного фенотипа установлено повышение уровней провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-2 и ИЛ-6 [24]. Противоположные изменения уровней цитокинов в головном мозге, наблюдаемые при формировании агрессивного поведения и его коррекции модулированными аминазином спленоцитами, свидетельствуют о цитокин-опосредованном механизме редактирования поведенческого фенотипа агрессивных реципиентов после трансплантации модулированных ex vivo ИКК.

Таким образом, установлено, что обработка in vitro аминазином спленоцитов агрессивных мышей изменяет функциональную активность клеток, что выражается в снижении стимулированной пролиферативной активности и продукции цитокинов ИЛ-2, ИЛ-6 и ИНФ-γ. Трансплантацией модулированных ex vivo аминазином сплено-цитов агрессивных мышей-доноров достигается редактирование паттернов агрессивных форм поведения сингенных реципиентов, о чем свидетельствует снижение агрессивной мотивации, уровней агрессивности, тревожности и локомоторной активности. Представленные результаты показывают перспективность применения клеточных технологий для коррекции агрессивного поведения.

Работа выполнена за счет средств федерального бюджета Российской Федерации, выделенных на выполнение фундаментальных научных исследований в ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», тема № 122011800324-4 (2021-2023).

Исследование было проведено с соблюдением норм современной биомедицинской этики и этических стандартов, разработанных в соответствии с Хельсинской декларацией ВМА (протокол заседания этического комитета НИИФКИ от 13.04.2022 г.).

Авторы статьи выражают благодарность д-ру биол. наук Т.Г. Амстиславской (НИИФМ) за помощь при проведении поведенческого фенотипи-рования.

Ader R. Psychoneuroimmunology. University of Chicago Press; 2007. V. 1. 1269 p.

Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л. Пси-хонейроиммуномодуляция: поведение и иммунитет. Роль «нейромедиаторной установки мозга». Новосибирск: Наука, 2009. 168 c. Devoino LV, Idova GV, Alperina EL. Psychoneuroim-munomodulation: behavior and immunity. The role of the "neurotransmitter installation of the brain". Novosibirsk: Nauka, 2009:168 (in Russian).

Крыжановский Г.Н., Асмаев И.Г., Магаев С.В., Морозов С.Г. Нейроиммуноэндокринные взаимодействия в норме и патологии. М. : Медицинская книга, 2010. 288 с. Kryzhanovsky GN, As-maev IG, Magaev SV, Morozov SG. Neuroim-munoendocrine interactions in health and disease. Moscow: Medical Book, 2010:288 (in Russian).

Ветлугина Т.П., Иванова С.А., Корнетов Н.А., Киселев Я.Ю., Прозументов А.Л. Возможные ме ханизмы иммунного влияния сертралина в динамике терапии депрессивных расстройствах. Российский психиатрический журнал. 1999. № 5. С. 35-39. Vetlugina TP, Ivanova SA, Kornetov NA, Kiselev YaYu, Prozumentov AL. Possible mechanisms of the immune effect of sertraline in the dynamics of therapy for depressive disorders. Russian Psychiatric Journal. 1999;5:35-39 (in Russian).

Иванова С.А., Гуткевич Е.В., Семке В.Я., Рядовая Л.А., Ракитина Н.М., Перчаткина О.Э., Епанчинцева Е.М. Методологические подходы к оценке биологических факторов психической дезадаптации (на примере невротических рас стройств): методические рекомендации. Томск, 2006. 33 с. Ivanova SA, Gutkevich EV, Semke VYa, Ryadovaya LA, Rakitina NM, Perchatkina OE, Epanchintseva EM. Methodological approaches to the assessment of biological factors of mental maladjustment (on the example of neurotic disorders): methodological recommendations. Tomsk, 2006: 33 (in Russian).

Ветлугина Т.П., Никитина В.Б., Лобачева О.А., Невидимова Т.И. Основы клинической психонейроиммунологии: учебно-методическое пособие. Ижевск: Типография-издательство «Книго-Град», 2014. 80 c. Vetlugina TP, Nikitina VB, Lo- bacheva OA, Nevidimova TI. Fundamentals of clinical psycho-neuroimmunology: teaching aid. Izhevsk: Printing House-Publishing House "Kni-goGrad", 2014:80 (in Russian).

Поступила в редакцию 24.06.2022 Утверждена к печати 29.08.2022

Маркова Евгения Валерьевна, д.м.н., заведующая лабораторией нейроиммунологии, главный научный сотрудник ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии»; главный научный сотрудник лаборатории молекулярной патологии ФГБОУ ВО «Новосибирский государственный университет». Author ID Sсоpus 35576645100. Author ID РИНЦ 109914. SPIN-код РИНЦ 8439-7310.

Correction of aggressive behavior patterns by ex vivo modulated immunocompetent cells: an experimental study

Markova E.V., Serenko E.V.

Federal State Budgetary Scientific Institution "Scientific Research Institute of the Fundamental and Clinical Immunology" Yadrintsevskaya Street 14, 630099, Novosibirsk, Russian Federation