Культуральные признаки и рост на сложных жидких питательных средах перспективного грибного штамма антагониста М-24 Penicillium sp. возбудителя фомоза подсолнечника

Введение. Гриб Plenodomus lindquistii (Frezzi) Gruyter, Aveskamp & Verkley, известен как возбудитель фомоза подсолнечника [1], который при благоприятных условиях может негативно влиять на качественные и количественные показатели семян культуры. При поражении подсолнечника фомозом в корзинках формируются мелкие недоразвитые семена с низкой всхожестью, а общая урожайность в зависимости от количества пораженных растений может снижаться на 25 % и более [2]. В настоящее время эта болезнь по распространению в России и в мире занимает лидирующее положение среди других болезней [3; 4; 5]. В последние годы погодные условия в Краснодарском крае способствовали появлению первоначальных симптомов фомоза на поверхности листьев, черешках и стеблях растений подсолнечника, однако засушливые летние месяцы препятствовали дальнейшему заражению, и развитие болезни не превышало 1–2 баллов [3].

Одним из направлений исследований в лаборатории биометода агротехнологиче-ского отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК является разработка микробиологического метода снижения вредоносности фомоза подсолнечника, в ходе которого проведен ступенчатый скрининг штаммов антагонистов из рабочей коллекции лаборатории к возбудителю болезни и выделены наиболее перспективные из них: 11-1 Bacillus sp. и М-24 Penicillium sp. Штаммы нефитотоксичны, показали лучший защитный и колонизирующий эффект на жестком фоне искусственного заражения во влажной камере и в грунте [6; 7]. Кроме того, штаммы проявили высокую ростостимулирующую активность по отношению к культуре подсолнечника [8].

Цель работы – изучение культуральных свойств на агаризированных средах и роста на сложных жидких питательных средах перспективного штамма М-24 Pen-icillium sp. для разработки элементов технологического регламента производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок при поверхностном культивировании штамма-продуцента.

Материалы и методы. Культуральные признаки штамма М-24 Penicillium sp. изучали в 2020 г. при температуре +25 °С, при культивировании моноконидиальной культуры в течение десяти суток на ага-ризированных средах в чашках Петри (ЧП): картофельно-сахарозном агаре (КСА) [9], Чапека [10] и Рудакова [11]. Поверхностное культивирование штамма осуществляли на жидких питательных средах при температуре +25 °С в течение десяти суток в колбах Эрленмейера (250 мл) с объемом питательной среды 100 мл, высевая одинаковый агаровый блок с моноконидиальной культуры штамма антагониста. Испытывали жидкие питательные среды: Рудакова, Чапека, Викерхема и № 1, содержащие углеводы и соединения азота, фосфора, калия и магния, а также микроэлементы в разном соотношении.

Учет роста гриба на жидких питательных средах проводили по разработанной нами шкале [7] (рис. 1):

0 – нет роста или только обрастание посевного блока;

• 1    – рост мицелия отдельными колониями;

• 2    – мицелиальная плёнка сплошная складчатая толстая;

• 3    – мицелиальная плёнка сплошная, складчатая, толстая, с частичным оседанием вглубь среды.

По окончании культивирования определяли сухой остаток мицелиальной массы после высушивания при температуре +105 °С до постоянного веса [12]. Повторность в каждом опыте трехкратная.

0 баллов              1 балл

2 балла

3 балла

Рисунок 1 – Рост штамма M-24 Penicilli-um sp. на жидких питательных средах в соответствии с разработанной шкалой по баллам (ориг.)

(ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2020 г.)

Результаты и обсуждение. Установлено влияние трех агаризированных питательных сред на культуральные признаки штамма М-24 Penicillium sp . на десятые сутки культивирования при температуре +25 °С (табл. 1, рис. 2).

Максимальный рост гриба отмечен на среде Рудакова, на которой колонии занимают наибольшую часть поверхности среды в ЧП. Колонии порошистые, с тонкой белой краевой зоной, с четко выраженными радиальными кругами. Цвет с лицевой стороны голубовато-оливковый, с обратной – охряно-желтый. На этой среде установлен максимальный диаметр колонии – 81 × 80 мм. Конидиальное спо-роношение обильное.

Культуральная характеристика штамма М-24 Penicillium sp. на десятые сутки культивирования на агаризированных питательных средах

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2020 г.

Среда	Характеристика колонии			Диаметр колонии, мм	Споро-ношение
	рост колонии	цвет, со стороны
		лицевой	обратной
КСА	Средний, порошистые, с тонкой бело-желтой краевой зоной, четко выражены радиальные круги	Светлозеленый	Желто-зеленый	66 × 66	Кони-диальное обильное
Чапека	Слабый, порошистые с широкой белой краевой зоной, с резным краем	Голубой	Зеленый	41 × 43	То же
Рудакова	Сильный, порошистые, с тонкой белой краевой зоной, четко выражены радиальные круги	Голубовато-оливковый	Охря-но-желтый	81 × 80	То же

Также обильный рост гриба антагониста отмечен на картофельно-сахароз-ном агаре: колонии порошистые, с тонкой бело-желтой краевой зоной и четко выраженными радиальными кругами. Цвет с лицевой стороны светло-зеленый, с обратной – желто-зеленый. Диаметр колонии уступал диаметру на среде Рудакова и составил 66 × 66 мм. Конидиальное спороношение обильное.

Слабый рост гриба установлен на среде Чапека: колонии порошистые, с более широкой белой краевой зоной, чем на предыдущих двух средах, но в отличие от них – с резным краем и без радиальных кругов. Цвет с лицевой стороны голубой, с обратной – зеленый. Диаметр колонии из трех испытанных сред минимальный – 41 × 43 мм. Конидиальное спороношение обильное.

Таким образом, культуральные свойства грибного штамма значительно колебались в зависимости от питательной среды. На всех агаризированных средах наблюдали обильное конидиальное спо-роношение. Сильный рост гриба и максимальный диаметр колоний (81 × 80 мм)

отмечен на среде Рудакова.

Таблица 2

КСА

Чапека

Рудакова

Рисунок 2 – Колонии штамма М-24 Penicillium sp. на агаризированных питательных средах при температуре +25 °С, через 10 суток культивирования (ориг.)

(ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2020 г.)

Определена оптимальная жидкая питательная среда сложного состава для стационарного культивирования штамма M-24 Penicillium sp. Испытаны среды Рудакова, Чапека, Викерхема и № 1 (табл. 2).

Влияние сложных жидких питательных сред на рост штамма-продуцента микробиопрепарата M-24 Penicillium sp. в условиях стационарного культивирования при температуре +25 °С

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2020 г.

Штамм	Рост мицелия, балл/сухая мицелиальная масса, г/100 мл среды
	сложная питательная среда
	Чапека	Рудакова	Викерхема	№ 1
M-24 Penicillium sp .	1/0,20 ± 0,04	3/1,44 ± 0,04	2/1,39 ± 0,04	2/1,34 ± 0,02

Установлено, что максимальный рост гриба наблюдался на среде Рудакова, где на десятые сутки стационарного выращивания образовалась сплошная толстая мицелиальная плёнка с обильным споро-ношением. На средах № 1 и Викерхема сформировалась сплошная тонкая мицелиальная плёнка со спороношением, а на среде Чапека – отдельные колонии, которые не срослись между собой и не образовали сплошную мицелиальную плёнку. Масса сухого мицелия через десять суток культивирования была максимальной на среде Рудакова (1,44 г на 100 мл питательной среды против 0,20–1,39 г на других средах).

Заключение. Изучены культуральные свойства перспективного штамма-продуцента микробиопрепарата M-24 Peni-cillium sp. – сильный рост гриба и максимальный диаметр колонии (81 × 80 мм) отмечен на агаризированной среде Рудакова. Для разработки элементов технологии производства микробиопрепарата в препаративной форме смачивающийся порошок при поверхностном культивировании гриба антагониста установлена оптимальная сложная жидкая питательная среда – Рудакова, на которой сформировалась толстая складчатая мицелиальная пленка с обильным спороношением и с максимальной массой сухого мицелия – 1,44 г на 100 мл питательной среды против 0,20–1,39 г на других средах.