Кумулятивные свойства кормовой добавки Vulpes Optima ZS с гистологической оценкой внутренних органов

Одним из перспективных направлений является использование нанотехнологий в создании кормовых добавок [6, 7]. Нано-структурированные материалы, благодаря высокому соотношению поверхности к объему и малым размерам частиц (1-100 нм), обладают уникальными физико-химическими свойствами, которые могут принципиально изменять фармакокинетику и биологическую активность вносимых веществ [8]. Они способны выступать в качестве эффективных систем доставки, обеспечивать контролируемое высвобождение и улучшенную абсорбцию действующих компонентов в желудочнокишечном тракте [9]. Однако, именно эти свойства обуславливают потенциальные риски, связанные с возможностью преодоления биологических барьеров, накопления в органах и тканях (кумуляции) и индукции непредсказуемых клеточных ответов [10, 11]. Поэтому, наряду с изучением эффективности, обязательным этапом доклинических исследований новых композитных добавок, содержащих наночастицы, является всесторонняя оценка их безопасности, включая анализ кумулятивного действия [12].

Кумуляция – это способность вещества накапливаться в организме при повторных введениях в субтоксических дозах и усиливать свое действие, что в итоге может привести к хронической интоксикации [13]. Исследование кумулятивных свойств позволяет прогнозировать риск отдаленных последствий при длительном применении, установить класс опасности и обосновать режимы дозирования с учетом необходимости периода выведения. Наиболее информативным методом является хронический эксперимент на лабораторных животных с постепенным повышением дозы, морфологическим и гистологическим контролем состояния органов-мишеней [14].

Целью настоящей работы явилась комплексная оценка кумулятивных свойств новой отечественной кормовой добавки «Vulpes Optima ZS», стабилизированной полиакрилатом натрия, в эксперименте на белых крысах с последующим гистологическим анализом внутренних органов.

Условия, материалы и методы. Работа выполнена на базе научно-исследовательской лаборатории кафедры физиологии, фармакологии и токсикологии при ФГБОУ ВО «Казанский государственный аграрный университет». Объектом изучения служила кормовая добавка «Vulpes Optima ZS», представляющая собой водную суспензию, стабилизированную полиакрилатом натрия и обогащенную комплексом микроэлементов в биодо-ступной форме. Исследование проведено на 30 половозрелых белых беспородных крысах -самцах со средней начальной массой 220±15 г. Животные были рандомизированы на две группы: опытную (n=20) и контрольную (n=10). Все особи содержались в виварии в стандартных условиях (температура 22±2 °C, влажность 50-60%, 12-часовой световой режим) на полнорационном комбикорме с неограниченным доступом к воде. За 14 дней до начала эксперимента животные находились на карантине для адаптации.

Кумулятивные свойства изучали в соответствии с требованиями МУ 1.2.2520-09 «Гигиеническая оценка безопасности наноматериалов» и методом R. K. Lim et al. (1961), основанном на определении кумулятивного коэффициента при длительном введении возрастающих доз. За исходную (минимальную) дозу была принята величина, составляющая 1/10 от ранее установленной в наших исследованиях сублетальной дозы (ЛД˅10) для данной добавки при однократном введении, что составило 0,045 мл/кг (0,05 мл на животное). Препарат вводили ежедневно внутрь с помощью атравматичного желудочного зонда. Дозу увеличивали в 1,5 раза каждые 4 дня на протяжении 28 суток. Контрольная группа получала эквивалентный объем деионизированной воды по аналогичной схеме. Схема дозирования представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Схема проведения кумулятивных исследований

Показатель, г/кг	Опыт, сутки
	1-4	5-8	9-12	13-16	17-20	21-24	25-28
Суточная доза	0,045	0,06	0,09	0,10	0,20	0,30	0,475
Суммарная доза за 4 дня	0,18	0,24	0,36	0,40	0,80	1,20	1,80
Суммарная доза	0,18	0,42	0,78	1,18	1,98	3,18	4,98
Летальность	-	-	-	-	-	-	-

Ежедневно фиксировали общее клиническое состояние животных: реакцию на внешние раздражители, двигательную активность, состояние шерстного покрова и слизистых оболочек. Дважды в неделю проводили индивидуальное взвешивание. Ежедневно учитывали поедаемость корма и потребление воды. Отдельно регистрировали акты мочеиспускания и дефекации. Все наблюдения документировали в протоколах.

«Микмед-5» с цифровой камерой при увеличениях х100, х200 и х400.

Для оценки динамики массы тела использовали методы параметрической статистики. Данные представлены как M±m (среднее арифметическое ± ошибка среднего). Достоверность различий между группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента, различия считали значимыми при p<0,05. Коэффициент кумуляции (Kкум) рассчитывали по формуле: Kкум = LD50(хрон) / LD50(остр), где LD50 (хрон) – суммарная доза, введенная за 28 дней, а LD50(остр) – средняя летальная доза при однократном введении. В нашем случае, при отсутствии летальности, в качестве знаменателя использовали максимальную однократно введенную дозу в эксперименте (0,45 г/кг), что является адаптированным подходом для оценки слабокумулирующих веществ.

Результаты и обсуждение. На протяжении первых 8 дней эксперимента животные обеих групп сохраняли активность, аппетит и физиологические показатели в пределах нормы. Первые транзиторные изменения в поведении особей опытной группы были отмечены на 9-е сутки при увеличении суточной дозы до 0,09 г/кг и достижении суммарной дозы 0,78 г/ кг. Они проявлялись кратковременным (до 3040 минут) снижением пищевой возбудимости после введения препарата, после чего потребление корма и воды полностью восстанавливалось. Более выраженные, но обратимые клинические признаки отмечались с 17-х суток при суточной дозе 0,2 г/кг (суммарная 1,98 г/кг). У части крыс наблюдалась легкая вялость, взъерошенность шерсти, стремление затаиться в углу клетки. Данные симптомы самостоятельно купировались в течение 1,5-2 часов после введения. Важно отметить, что ни на одном этапе эксперимента не было зафиксировано отказа от корма и воды на протяжении всего светового дня, а также не было отмечено случаев диареи или других нарушений со стороны желудочнокишечного тракта. Летальность в опытной группе отсутствовала на всех этапах, сохранность поголовья составила 100%.

Темпы прироста массы в опытной группе несколько отставали от контрольной в периоды введения повышенных доз (3-я и 4-я недели), однако статистически значимых различий между средними значениями массы в контрольной и опытной группах на конец эксперимента выявлено не было. Это свидетельствует об отсутствии токсического эффекта, связанного с нарушением нутритивного статуса или катаболическими процессами.

Расчет коэффициента кумуляции по результатам 28-дневного эксперимента составил согласно формуле: Ккум = 4,98 / 0,45 = 11,06.

Согласно общепринятой классификации K. С. Ладогина (1973) и современных руководств, вещества по степени кумуляции делятся на 5 классов: I – сверхсильная (Kкум < 1), II – выраженная (Ккум = 1-3), III - умеренная (Ккум

= 3-5), IV - слабая (Ккум = 5-10) и V - практическое отсутствие кумуляции (Ккум > 10).

Полученное значение (11,06) позволяет отнести кормовую добавку «Vulpes Optima ZS» к IV-V классу – веществам со слабовыраженными кумулятивными свойствами, что указывает на ее низкую способность к накоплению в организме и высокий профиль безопасности при пролонгированном применении.

Гистологический анализ подтвердил данные макроморфологии. В печени (рис. 1) сохранена классическая дольковая архитектоника. Гепатоциты образуют четкие печеночные балки радиальной ориентации. Ядра клеток округлые, везикулярные, с хорошо различимыми ядрышками, расположены центрально. Цитоплазма гепатоцитов гомогенная или мелкозернистая, без признаков вакуольной или гидропической дистрофии. Портальные тракты и центральные вены не изменены. Признаков холестаза, лобулярного воспаления или фиброза не выявлено.

Рисунок 1 – Гистологический срез печени крысы опытной группы. Окраска гематоксилином и эозином (увеличение ×200). Сохранена структура печеночных долек, гепатоциты без признаков дистрофии.

В почках (рис. 2) сохранено кортикомедуллярное строение. Клубочки интактны, сосудистые полости не расширены. Эпителий проксимальных и дистальных извитых канальцев цилиндрический, с базофильной цитоплазмой, четко очерченными апикальными краями; просветы канальцев свободны. В строме органа отсутствуют лимфоидные инфильтраты или очаги склероза.

Рисунок 2 – Гистологический срез коркового вещества почки крысы опытной группы. Окраска гематоксилином и эозином (увеличение ^400. Видны интактные почечные тельца и эпителий канальцев.

Слизистая тонкого кишечника (рис. 4) характеризуется высокой ворсинчатостью. Ворсинки покрыты однослойным каемчатым цилиндрическим эпителием с высокой плотностью бокаловидных клеток, содержащих слизистый секрет. Крипты Либеркюна углублены, в их основании видны фигуры митозов, что свидетельствует о нормальной регенераторной активности. Подслизистый и мышечный слои не изменены.

Рисунок 4 - Гистологический срез стенки тонкой кишки крысы опытной группы. Окраска гематоксилином и эозином (увеличение х100). Длинные ворсинки, интактный эпителий.

Полученные гистологические данные однозначно свидетельствуют об отсутствии токсико-дистрофических, воспалительных или пролиферативных изменений в ключевых органах детоксикации (печень), выделения (почки) и абсорбции (ЖКТ) под влиянием длительного введения исследуемой добавки. Это согласуется с результатами клинических наблюдений и подтверждает вывод о низкой кумулятивной опасности препарата.

Выводы. В ходе 28-суточного эксперимента на белых крысах установлено, что кормовая добавка «Vulpes Optima ZS» обладает слабовыраженными кумулятивными свойствами, что подтверждается рассчитанным коэффициентом кумуляции (Kкум = 11,06), соответствующим IV-V классу опасности. Клинические признаки интоксикации у животных носили обратимый, транзиторный характер и проявлялись лишь на фоне введения высоких суточных доз (с 0,2 г/кг), не приводя к статистически значимому снижению живой массы и сохранности поголовья. Комплексное патологоанатомическое и гистологическое исследование не выявило деструктивных, воспалительных или дистрофических изменений в паренхиматозных органах (печень, почки) и отделах желудочно-кишечного тракта, что является морфологическим обоснованием безопасности добавки. Полученные результаты позволяют рекомендовать кормовую добавку «Vulpes Optima ZS» для дальнейших исследований эффективности в качестве безопасного компонента рациона сельскохозяйственных животных при условии соблюдения рекомендуемых режимов дозирования.