Лабораторный феномен ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов

водит к недостаточной информированности врачей и к принятию тактически неверных решений. Обнаружение у пациента низких или критически низких цифр содержания тромбоцитов в периферической крови может быть интерпретировано как истинная тромбоци-топения,что обязательно потребует допол- нительного обследования и связанных с этим временных, экономических и эмоциональных затрат. В некоторых случаях возможна постановка неверного диагноза с началом агрессивной терапии,а несвоевременное определение причины снижения тромбоцитов на этапе предоперационной подготовки может нести тяжелые последствия для пациентов с ургентной патологией. Коварство ЭДТА-ассоциированной агрегации тромбоцитов также связано с нарастанием псевдотромбоцитопении пропорционально времени взятия и хранения образца крови,что делает практически невозможным динамическое наблюдение за показателями тромбоцитов. Таким образом, редкость явления нисколько не уменьшает его значимости для конкретного пациента и требует особого внимания, как от врачей-клиницистов, так и от врачей лабораторной службы.

Материалы и методы . В интервале с 2014 по 2017 год было обследовано 22836 пациен-тов,первично обратившихся в ФГБУ «ВЦЭРМ им.А. М.Никифорова» МЧС России.При выявлении тромбоцитопении клинический анализ крови проводился в образцах, взятых одновременно в два вакутейнера: с К₂ЭДТА и цитратом Na.Все образцы были проверены на гематологическом анализаторе Beckman Coulter LH750, также во всех случаях проводилась микроскопия мазков крови.

Результаты. В результате проведенного исследования был выявлен 31 случай ЭДТА-за-висимой агрегации тромбоцитов,что составило 0,13 % от общего числа проб. Группу составили 14 мужчин (45 %) в возрасте от 22 до 81 года и 17 женщин (55 %) в возрасте от 24 до 80 лет. Взаимосвязи появления ЭДТА-зави-симой псевдотромбоцитопении с полом или возрастом обнаружено не было. Также феномен проявлялся у пациентов вне зависимости от диагноза.При исследовании образцов крови в пробирках с ЭДТА на гематологическом анализаторе отметка об агрегации тромбоцитов всегда сопровождалась указанием на ложный лейкоцитоз, числовое выражение которого находилось в обратной зависимости от степени тромбоцитопении. При микроскопии мазков всегда отмечалось наличие тромбоцитарных агрегатов,сопоставимых по размеру с размером лейкоцитов.Было отмечено нарастание тромбоцитопении при хранении пробы с течением времени.При прицельном анализе одной пробы было показано, что агрегаты появлялись по мере снижения температуры образца до ком- натной, а при помещении исследуемого образца в условия + 5оС в течение 30 минут обнаруживалась выраженная агрегация тромбоцитов и максимальная цифра ложного лейкоцитоза. Помещение образца крови в термостат (+ 37оС) не приводило к диссоциации тромбоцитарных агрегатов. Факт наличия именно ЭДТА-ассо-циированной агрегации был подтвержден отсутствием агрегатов в пробах с цитратом Na у этих же пациентов.

Обсуждение . Явление ЭДТА-ассоциированной псевдотромбоцитопении широко описано в литературе. Первое ее упоминание относится к 1978 году [2]. В 1982 году были опубликованы работы по поиску антител, предположительно являвшихся непосредственной причиной агрегации тромбоцитов в присутствии ЭДТА. Было отмечено, что агрегация тромбоцитов в ЭДТА-стабилизированной пробе максимально проявлялась при температуре от 0 до +4 °C [3]. В 1986 году японскими учеными было предложено использовать MgSO₄ в качестве антикоагулянта для корректного определения количества тромбоцитов у пациентов с феноменом ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов [4]. Тогда же было высказано предположение, что так называемый клеточный сателлизм, слипание тромбоцитов с лейкоцитами in vitro, также встречается в пробах с ЭДТА-консервантом [5],а агрегаты тромбоцитов из-за схожести в размере могут распознаваться гематологическим анализатором как лейкоциты, что приводит к появлению ложного лейкоцитоза [6]. Было предложено использовать цитрат натрия в качестве альтернативного антикоагулянта при ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов [7]. В наших наблюдениях указание на ложный лейкоцитоз встречалось в 100% случаев, а явление клеточного сателлизма было отмечено при микроскопическом исследовании только в одной пробе с ЭДТА, который действительно не отмечался в образце с цитратом натрия.

В последующих работах была отмечена быстрая диссоциация агглютинированных тромбоцитов после добавления канамицина (20 мг) в 1 мл ЭДТА-антикоагулированной крови [8].Нами был проведена попытка применения канамицина для диссоциации агрегатов в исследованных пробах,но положительных результатов получено не было.

Также в отдельных исследованиях обнаружено, что антитела, присутствовавшие у пациентов с феноменом ЭДТА-зависимой агрегации, направлены против мембранного антигена GP78, участвующего в агрегации тромбоцитов вместе с гликопротеиновым комплексом IIb/

IIIa [9]. Агглютинирующими антителами были признаны IgA — в 40 % случаев, IgG — в 30 % наблюдений и IgM — у 10 % пациентов. Полученные данные позволили сделать вывод, что ЭДТА-зависимая псевдотромбоцитопения вызвана агглютинирующими антителами, которые распознают цитоадгезивные рецепторы на тромбоците GPIIb — IIIa [10].

В 2012 году группой исследователей [11] было решено, что анализ образцов крови, содержащих цитрат натрия, взятых для определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ), является приоритетным методом в определении точного числа тромбоцитов.

Тогда же, в 2012 году, Lippi G., Plebani M. [12] было предложено пять основных критериев ЭДТА-зависимой псевдотромбоцитопении:

• —    низкое количество тромбоцитов (обычно <100 × 10^9/л);

• —    возникновение тромбоцитопении в образцах сЭДТА прикомнатнойтемперату-ре без подтверждения в пробах, собранных с другими антикоагулянтами, и/ или нагретых до температуры ~ + 37 °C

• —    снижение количества тромбоцитов в пробе с ЭДТА при хранении;

• —    выявление агрегатов тромбоцитов в ЭДТА-стабилизированных образцах при помощи показателей анализаторов или при помощи микроскопии;

• —    отсутствие клинических признаков или симптомов тромбоцитопении.

Этими же исследователями предложено несколько способов предупреждения ЭДТА-зави-симой агрегации тромбоцитов,таких как нагревание образца до 37 °C,добавление веществ или специальных антикоагулянтов (буферный цитрат натрия, гепарин, оксалат аммония, β– гидроксиэтилтеофиллин, фторид натрия, CPT (тринатрийцитрат, пиридоксальный 5’–фосфат и трис), антиагреганты, азид калия, амикацин, канамицин или другие аминогликозиды, замещение кальция одновременным добавлением хлорида кальция/гепарина). Было подтверждено, что наиболее подходящим для пациентов с ЭДТА-ассоциированной агрегацией тромбоцитов является анализ образцов крови с использованием цитрата натрия, СРТ или хлорида кальция/гепарина в качестве добавок, а также сохранение образцов крови при + 37 °C до момента определения количества тромбоцитов.

В 2014 году Nagler M. и соавт. отметили, что ЭДТА-псевдотромбоцитопения может легко диагностироваться даже врачами общей прак- тики без какого-либо опыта в лабораторных гематологических исследованиях. Был представлен первый отчет, иллюстрирующий типичные схемы гистограмм гематологического анализатора распределения тромбоцитов (PLT) и лейкоцитов (WBC) на примере клинического случая 37-летней пациентки с подозрением на острый лейкоз.Исследование образца крови с ЭДТА выявило атипичные лимфоциты и изолированную тромбоцитопению вместе с типичными образцами гистограмм лейкоцитов и тромбоцитов: зубчатую кривую гистограммы тромбоцитов и особый пик на левой стороне гистограммы лейкоцитов. ЭДТА-псевдотром-боцитопения была подтверждена нормальным количеством тромбоцитов при исследовании крови с цитратом натрия [13].

В 2015году было проведено ретроспективное исследование случай–контроль на основе базы данных Больницы Университета Токио. Авторами проанализированы 104 пациента с диагнозом ЭДТА-псевдотромбоцитопении в период с 2009 по 2012 год. Изучалась частота осложнений и течение болезни.Прогноз оценивали с использованием многовариантного регрессионного анализа Кокса, учитывающего возраст, пол, наличие аутоиммунных заболеваний, заболеваний печени и злокачественных опухолей. У пациентов с ЭДТА-ассоциированной агрегацией тромбоцитов была более высокая частота злокачественных опухолей и более низкая частота гипертонии и диабета,чем в контрольной группе.После корректировки фоновых факторов прогноз пациентов с ЭД-ТА-псевдотромбоцитопенией был значительно хуже, чем у пациентов контрольной группы, так как они имели более высокую смертность [14].

В 2017 году Shi X. и соавт. опубликовали случай ЭДТА-индуцированной агрегации тромбоцитов у 68–летнего пациента с послеоперационным сепсисом,у которого в послеоперационном периоде развилась выраженная тромбоцито-пения.Примечательно было то,что феномен ЭДТА-псевдотромбоцитопении исчез, когда пациент был успешно пролечен.Было сделано заключение,что низкое количество тромбоцитов у послеоперационных больных с сепсисом можно рассматривать как возможное проявление ЭДТА-псевдотромбоцитопении [15], хотя в этой группе тромбоцитопения может наблюдаться по клиническим причинам,например, при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Также в 2017 году Titou H. и соавт. отметили, что микроскопическое исследование мазков периферической крови имеет ключевое значение для подтверждения правильного диагноза и позволяет дифференцировать артефакт ЭДТА-зависимой псевдотромбоцитопении и гепарин–индуцированную тромбоцитопеню [16].

Таким образом, в течение почти 40 лет феномен ЭДТА-зависимой агрегации тромбоцитов периодически становится объектом пристального изучения, оставляя актуальными вопросы быстрой и своевременной диагностики,про-гностического значения феномена ЭДТА-ассо- циированной агрегации тромбоцитов,а также некоторые вопросы патофизиологии самого процесса. Поскольку ЭДТА-псевдотромбоцито-пения — это лабораторный феномен,на аналитическом этапе лабораторных исследований необходим алгоритм его быстрого обнаружения и определение истинного количества тромбо-цитов,который заключается в использованном нами методе выполнения клинического анализа крови на гематологическом анализаторе одновременно из двух проб — с К2ЭДТА и цитратом натрия.