Лечение острого мастита у коров с применением бактериофагов

Бактериальная контаминация молочной железы коров на сегодняшний день является наиболее актуальной проблемой. Широкое и не всегда рациональное применение различных препаратов антимикробного действия сопровождается нарушением биологического равновесия микроорганизмов в эволюционно устойчивых экологических системах микробных ассоциаций, что способствует появлению устойчивых к антибиотикам штаммов, изменяющих микробный состав молочной железы коров [1; 2; 11].

Фармакологическая индустрия постоянно направляет свои усилия на разработку новых препаратов, их комбинаций. Как правило, препараты являются токсичными и вредными для человека [3]. После термической обработки продуктов животноводства, используемых в пищу, антибиотики, содержащиеся в них, приобретают свойства сильнейших аллергенов.

Цель исследования – изучить качественный и количественный состав микрофлоры молока от коров при остром мастите и выделить эффективный специфический бактериофаг для лечения больных животных.

Материалы и методы

Бактериологические исследования с целью выделения возбудителей и подбора гомологичного бактериофага были проведены на базе БУ «Омская областная ветеринарная лаборатория». Выделение вирулентного бактериофага, комплементарного штамму микроорганизма и играющего этиологическую роль в развитии инфекционного процесса, проводили из проб сточных вод хозяйства.

Для выделения бактериофага исследуемый материал доставляли в лабораторию в течение 2–3 ч, затем готовили ряд последовательных разведений от 101 до 1010. Из приготовленных разведений производили посевы на питательные среды для культивирования различных видов микроорганизмов. При этом использовали следующие питальные среды: скошенный мясо-пептонный агар (МПА); солевой агар; энтерококкагар; агар Эндо; агар Левина и Плоскирева; агар Сабуро. Все посевы (за исключением посевов на агаре Сабуро) культивировали при 37ºС в течение 24 ч и оставляли еще на 24 ч при комнатной температуре. Посевы на агаре Сабуро культивировали при 27ºС в течение 5 сут с ежедневным контролем на наличие роста. Количество живых микробных клеток в 1 мл молока для каждого вида микроорганизмов рассчитывали по формуле

М = 10 · N · 10n, где М – число живых микробных клеток в 1 мл молока; N – количество колонеобразу-ющих едениц; 10 – коэффициент перерасчета при высеве 0,1 мл бактериальной взвеси; 10n – разведение, из которого выделен данный микроорганизм.

Родовую и видовую дифференциацию выделенных микроорганизмов проводили согласно определителю бактерий Берджи (1997) и определителю зоопатогенных микроорганизмов М.А. Сидорова с соавт. (1995). Гемолитические свойства выделенных микроорганизмов определяли на КА с добавлением 5% эритроцитов барана. Патогенность изучали путем постановки биопробы массой 16 ± 2 г на белых мышах, которым вводили внутрибрюшинно взвесь выделенных культур в дозе 0,5 мл с концентрацией 0,25 · 109; 0,5 · 109 и 1 · 109 м.т./мл. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Клиническое наблюдение за животными осуществляли в течение 10 сут. Работу с лабораторными животными проводили согласно «Правилам работы с использованием экспериментальных животных» [8].

Лечение крупного рогатого скота черно-пестрой породы с острым клиническим маститом (n = 60) было проведено в молочном хозяйстве Омской области. Коровы были поделены на 3 группы. С лечебной целью в первой опытной группе животных применяли суспензию бактериофага штамма Phagum Staphylococcus aureus RA-1. Данный штамм выделен стандартным методом – путем высева образцов стоков хозяйства в суспензию бактериальной культуры Staphylococcus aureus с последующим выделением единичных пятен лизиса на агаризованной поверхности. Препарат вводили 3 раза в сутки, по 8,0 мл, в течение 20 дней, интерцистернально.

Во второй опытной группе животных применяли «Мастиет Форте» производства Intervet International B.V., предварительно определив чувствительность выделенной микрофлоры к данному препарату, согласно инструкции, в течение 20 дней. Препарат вводили интерцистернально. После введения препаратов производили легкий массаж пораженных долей вымени.

Лечение коров с маститом в третьей опытной группе проводили по схеме сочетанного применения бактериофага штамма Phagum Staphylococcus aureus RA-1 и препарата «Мастиет Форте», в течение 20 дней.

Контроль выздоровления осуществляли, используя препарат «Кенотест» (CID LINES) и результаты бактериологическх посевов молока.

Результаты и их обсуждение

При изучение роли условно-патогенной микрофлоры в этиопатогенезе маститов у коров черно-пестрой породы, больных острой формой мастита, проведено комплексное микробиологическое исследование проб молока и экссудата молочной железы.

При микробиологическом исследовании 235 проб экссудата молочной железы больных коров установлено, что в микробном составе смешанные формы микроорганизмов постоянно преобладали над монокультурами и составляли соответственно 88,96 и 11,04%, при этом ассоциации микроорганизмов, как правило, состояли из двух, реже трех видов микроорганизмов.

■ Ассоциации    Монокультуры

Рис. 1 . Микрофлора молока и экссудата молочной железы коров, больных острой клинической формой мастита

Условно-патогенная микрофлора выделена из 4,56–6,28% исследованных проб. Ведущее место среди монокультур занимали представители двух родов – Staphylococcus и Streptococcus. Среди рода Staphylococcus наибольший удельный вес принадлежит Staph. aureus (47,82%) и коагулезоотрицательному эпидермальному стафилококку – Staph. epidaermidis (16,2%).

Второе место по частоте выделения микроорганизмов из экссудата молочной железы больных маститом в острой форме коров занимали стрептококки (Str. agalactiae –

12,6%). Стрептококки (Str. agalactiae) составляли 2,38% от общего числа исследованных проб секрета молочной железы коров с острой формой мастита.

■ Staph. aureus

■ Staph. epidaermidis

■ Str. agalactiae

■ Escherichia coli

- Ps. auruginosae

— P. vulgaris

Рис. 2 . Представители микрофлоры молока коров, больных маститом в острой форме

Микроорганизмы рода Escherichia (E. coli), Pseudomonas (Ps. auruginosae) и Proteus (P. vulgaris) изолированы в 9,8; 7,98 и 5,6% случаев от общего числа исследованных проб соответственно. При исследовании 182 проб молока, полученных из клинически здоровых долей молочной железы коров, выделена схожая условно-патогенная микрофлора.

Гемолитической активностью обладали пять изолированных культур, у которых была также определена патогенность при постановке биопробы. Так, культуры P. vulgaris , Str. agalactiae, E. coli и Ps. auruginosae были патогенны для белых мышей в дозе 0,5 · 10⁹ м.к./мл; Staph. aureus – в дозе 0,25 м.к./мл, вызывая гибель более 50% зараженных животных.

При заражении культурой Staph. epidaermidis в дозе 0,5 · 109 м.т./мл гибель лабораторных животных не регистрировали (табл. 1).

Таблица 1

Патогенность культур микроорганизмов, выделенных из молочной железы больных коров

№ п/п	Культура микроорганизмов	Доза заражения, ×109 м.к.	Данные		Летальность, %
			Выжило	Пало
1	Staph. aureus	0,5	–	6	100
		0,25	3	3	50
2	Staph. epidaermidis	1,0	4	2	33,3
		0,5	–	–	–
3	Str. agalactiae	1,0	1	5	83,3
		0,5	3	3	50
4	E. coli	1,0	–	6	100
		0,5	3	3	50
5	Ps. auruginosae	1,0	–	6	100
		0,5	3	3	50
6	P. vulgaris	1,0	–	6	100
		0,5	3	3	50

В группе мышей, зараженных β-гемолитической культурой E. coli в дозе 0,5 · 109 м.к./мл, на 5–6-е сутки погибло три особи (50%), а при заражении 1 · 109 м.к./мл – все в течение первых сут. При бактериологическом посеве на МПА из печени, почек, селезенки и брыжеечных лимфоузлов животных была выделена исходная культура E. coli.

Пять из шести мышей, зараженных Str. agalactiae в дозе 1 · 10⁹ м.к./мл, погибли в течение двух суток. При заражении в дозе 0,5 · 10⁹ м.к./мл регистрировали гибель трех животных в течение 6–7 сут. При посеве из паренхиматозных органов и брыжеечных лимфатических узлов мышей также была выделена культура Str. agalactiae .

В группе животных, зараженных культурой Staph. aureus в дозе 0,25 · 10⁹ м.к./мл, погибло три особи, а в дозе 0,5 · 10⁹ м.к./мл – пало шесть мышей через восемь суток. При посеве из паренхиматозных органов выделили исходную культуру Staph. aureus .

В сравнении с данными, полученными при исследовании проб до начала лечения, установили, что после проведенной терапии состав микрофлоры молока претерпел существенные изменения. В первой опытной группе, где животные получали терапию препаратом бактериофага, в пробах не регистрировали выделение Staph. aureus. Всего было выделено 5 видов микроорганизмов, а именно Staph. epidaermidis (32,7%), Str. aga-lactiae (27,3%), E. coli (16,5%), Ps. auruginosae (14,1%), P. vulgaris (9,4%).

Во второй опытной группе, где проводили лечение мастита с применением «Ма-стиет Форте», в пробах секрета молочной железы выделяли Staph. aureus (58,2%) и Staph. epidaermidis (41,8%).

В третьей опытной группе на фоне применения суспензии бактериофага штамма Phagum Staphylococcus aureus RA-1 и «Мастиет Форте» у всех больных животных были выделены культуры микроорганизмов – Staph. epidaermidis.

Таблица 2 Микрофлора молока коров с острым маститом при сочетанном лечении

(«Мастиет Форте» и бактериофаги штамма Phagum Staphylococcus aureus RA-1)

Вид микроорганизма	До лечения		3-и сут	7-е сут	20-е сут
	Доля отдельных видов в микрофлоре (в % от ОМЧ)	lg КОЕ/мл	lg КОЕ/мл	lg КОЕ/мл	lg КОЕ/мл
Staph. aureus	47,82	9,44 ± 6,80	5,37 ± 3,35	–	–
Staph. epidaermidis	16,2	4,65 ± 3,24	3,6 ± 3,24	5,47 ± 3,99	5,47 ± 3,99
Str. agalactiae	12,6	2,45 ± 1,52	2,45 ± 1,52	–	–
E. coli	9,8	7,47 ± 5,40	2,9 ± 3,60	5,47 ± 3,99	–
Ps. auruginosae	7,98	6,93 ± 5,01	2,85 ± 3,32	5,39 ± 3,93	–
P. vulgaris	5,6	6,54 ± 4,48	2,71 ± 2,71	4,30 ± 3,15	–
Ср. кол-во видов микроорганизмов, выделенных из одной пробы	5,5 ± 0,5		5,0	3,5 ± 0,5	1,0
ОМЧ: КОЕ/мл lg КОЕ/мл	3,3 · 109 9,51 ± 6,74		3,48 · 106 6,53 ± 4,40	3,5 · 106 6,54 ± 4,60	1,08 · 107 7,03 ± 4,77

Заключение

Элиминация патогенных и условно-патогенных возбудителей (Staph. aureus Str. agalactiae, E. coli, Ps. auruginosae, P. vulgaris) из микрофлоры молока и экссудата молочной железы под воздействием комплексного применения препаратов проходила в среднем на 11-е сутки.

Полученные микробиологические показатели свидетельствуют о положительном терапевтическом эффекте сочетанного применения антибиотикотерапии с бактериофагом.

R.A. Talipov, T.I. Lohrengel, K.V. Potiy

Omsk State Agrarian University named after P.A. Stolypin, city of Omsk

Treatment of acute mastitis with the use of bacteriophages in cows