Метаболические основы создания искусственных консорциумов микроорганизмов для утилизации загрязнителей различной природы

Содержащиеся в сточных водах разнообразные вещества, попадая в значительных количествах в водоемы или скапливаясь в почве, могут быстро загнивать и ухудшать санитарное состояние водоемов и атмосферы, что является одной из важных экологических проблем.

Существуют биологические ассоциации - консорциумы, применяемые в различных областях науки, промышленности и сельского хозяйства, которые превосходят монокультуры, 97

по многим показателям. Одними из таких являются почвенные микроорганизмы, разлагающие органические субстанции и образующие ценные формы гумуса. В результате этих процессов наряду с углекислым газом освобождаются минеральные вещества для питания растений [1, 2, 3].

К таким ассоциациям также относятся консорциумы для очистки сточных вод, которые подразделяются в зависимости от типа биологической очистки (анаэробная или аэробная) и основных групп загрязнителей. В процессах аэробной очистки задействован природный активный ил, позволяющий очищать различные загрязняющие вещества, поступающие на очистку до простых веществ. Активный ил является сложным структурированным биоценозом микроорганизмов, обитающих в воде и почве, обладающим высокой сорбционной способностью [5]. Для анаэробной очистки используют микроорганизмы рода Methanospirillum, Methanosarcina и др., используемые в метантенках, искусственно созданных сооружениях. В метантенках сбраживаются осадок первичных отстойников и активный ил метанобразующих бактерий [4].

На основе изучения путей метаболизма, симбиотических отношений природных биологических ассоциаций можно создать синтетический консорциум микроорганизмов в зависимости от природы загрязнителей и получить удовлетворительный результат в области очистки сточных вод, что в настоящее время является актуальной задачей в результате негативного техногенеза на окружающую среду и особенно в водосборной зоне оз. Байкал. Задачи исследования:

• 1)    рассмотреть основные группы загрязнителей сточных вод для выбора культур микроорганизмов, обладающих высокой активностью по отношению к ним;

• 2)    рассмотреть пути метаболизма выбранных культур микроорганизмов и возможность их совместного культивирования для эффективной утилизации загрязнителей сточных вод до простых соединений;

• 3)    подготовить рекомендации по научно обоснованному применению результатов настоящего исследования.

Результаты и обсуждение

Первые исследования взаимодействия микроорганизмов были проведены еще Л. Пастером, С.Н. Виноградским и др. Эти исследования доказали определяющую роль существования разных культур микроорганизмов в ассоциации, заключающуюся в их способности окислять разные компоненты среды и использовать продукты реакции в качестве субстратов для других микроорганизмов [6, 7].

С использованием модельной сточной воды были исследованы выделенные из природных источников микроорганизмы-деструкторы органических веществ и их условия роста. В результате исследований процессов деструкций у активных микроорганизмов установлено, что у таких микроорганизмов биохимические реакции происходят в 4 этапа.

I этап - аммонификация и ацетатное брожение. Пептон утилизируется в процессе аммонификации в результате действия следующих культур микроорганизмов Bacillus subtilis, Bacillus mycodies, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Pseudomonas aeruginosa .

Процесс аммонификации протекает в две стадии:

• 1.    Декарбоксилирование – образование углекислого газа и первичных аминов из аминокислот, образуемых в результате протеолиза. Образовавшиеся первичные амины R-CH 2 NH 2 окисляются при взаимодействии с кислородом до воды, углекислого газа и азота.

• 2.    Дезаминирование – отщепление аминогрупп, приводящее к выделению аммиака. Образовавшиеся α -кетокислоты при дезаминировании, расщепляются до СО 2 и Н 2 О . Образовавшийся аммиак на стадии 2 связан с процессом нитрификации.

Возможно ацетатное брожение, осуществляемое культурами Escherichia coli и Streptococcus thermophilus, которые получают электроны из ацетатного остатка, получаемого при диссоциации натрия ацетата модельной сточной воды.

Образуемый (H⁺) выступает в качестве донора электронов для других реакций, (CH 3 COO^-) связывается с ионами Na, образуя натрия ацетат, который участвует в образовании углекислого газа, используемый метанобактериями рода Methanobacterium thermoautotrophi-cum [8, 9, 10].

II этап - процесс нитрификации (окисление нитрита до нитрата с выходом свободной энергии). Это длительный процесс, в котором участвуют Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas aestuarii [11]. Первая стадия - окисление аммиака гидрофосфат аммония - (NH 4 ) 2 HPO 4 до нитрит-аниона. Вторая стадия - окисление нитрит-аниона до нитрат-аниона, с участием культур Nitrobacter alkalicus, Nitrobacter winogradskyi :

NO 2 ^-+ H 2 O => NO 3 ^-+ 2H⁺+ 2e^- [11]. (1)

Нитрат-анион является субстратом денитрификации, в результате образуется молекулярный азот при участии выбранной культуры Pseudomonas aeruginosa . Процесс нитрификации непосредственно связан с процессом денитрификации.

Возможно участие сульфатредуцирующих микроорганизмов Desulfosarcina variabilis, Desulferella acetivorans , способных кроме восстановления нитритов до аммония участвовать в диссимиляционной сульфатредукции, используя сульфат магния.

MgSO 4 => Mg²⁺ + SO 4 ^2-. (2)

SO 4 ^2- +2H⁺ +ATФ => AФС + PP i , (3) где АФС - аденозинфосфосульфат; PP i - пирофосфат.

У многих бактерий аденозинфосфосульфат (АФС) подвергается еще одному фосфорилированию с участием АТФ, в результате которого образуется фосфоаденозинфосфосульфат, который восстанавливается с образованием сульфита в реакции, катализируемой редуктазой, конечным продуктом является сульфит-анион.

Под действием процесса гидролиза тиосульфат натрия превращается в пиросульфат натрия (Na 2 S 2 O 5 ), реакция обратима, в следующем процессе пиросульфат натрия при нагревании до температуры 50 ° С образует сульфит натрия и небольшое количество диоксида серы.

Диоксид серы растворяется в воде с образованием сернистой кислоты, реакция обратима. Сульфит натрия диссоциирует в водной фазе на сульфат-ион (SO 3 ^2-) и ион натрия (Na⁺), который участвует в К-Na насосе, в удалении избытка ионов Са²⁺ из клетки и активном транспорте аминокислот внутри клетки микроорганизмов.

Механизм восстановления сульфита, образованного в результате реакций, до H 2 S при диссимиляционной сульфатредукции до конца не выяснен.

В реакции регенерируется сульфит, служащий субстратом [12, 13]. Не исключено, что у разных представителей группы восстановление сульфита до сульфида происходит по одно-или трехступенчатому пути.

Культура Thiobacillus denitrificans способна использовать карбонат из гидрокарбоната натрия и карбоната натрия модельной сточной воды в качестве источника углерода. Реакция разложения карбоната натрия проходит в 3 стадии.

Реакция разложения гидрокарбоната натрия проходит в одну стадию с образованием углекислого газа, воды и щелочи, которая диссоциирует до катиона Na+ и воды:

Часть ацетат-аниона идет на образования ацетата натрия: ацетат-анион (CH 3 COO^-) связывается с ионами Na, образуя натрия ацетат и углекислый газ, используемый метанобактери-ями рода Methanobacterium thermoautotrophicum .

NaHCO 3 + CH 3 COOH => CH 3 COONa + H 2 O + CO 2 ↑. (4)

Другая часть идет на образование метана:

CH 3 COOH => CH 4 ↑ + CO 2 ↑. (5)

• III    этап - процесс денитрификации (восстановление нитрата до азота). Нитрификация осуществляется Pseudomonas aeruginosa в анаэробных условиях и подавляется в присутствии молекулярного кислорода . Катализирует реакцию нитратредуктаза.

NO 3 ^-=> NO 2 ^-=> NO => N 2 O => N 2 . (6)

В качестве источника энергии микроорганизмы могут использовать нитрат калия и нит-рат-анион, образуемый на этапе нитрификации [11].

• IV    этап - образование метана из ацетата и карбонатов. В процессе принимают участие культуры Methanobacterium thermoautotrophicum , ассимилируя ацетаты, образуемые в результате реакции (4). Метан подвергается дальнейшей ассимиляцией культурой Methylomonas methanica с образованием метанола, формальдегида и муравьиной кислоты.

Муравьиная кислота расщепляется культурой Escherichia coli до углекислого газа и молекулярного водорода с помощью формиат-гидроген-лиазы:

HCOOH => CO 2 +2H .                       (7)

Метаногенные бактерии Methanobacterium thermoautotrophicum в основном получают энергию за счет окисления молекулярного водорода:

4Н 2 + СО 2 => СН 4 + 2Н 2 О.                        (8)

В компонентах модельной сточной воды присутствуют соединения в составе которых фосфорные остатки KH 2 PO 4 - дигидрофосфат калия и (NH 4 ) 2 HPO 4 - гидрофосфат аммония под воздействием реакции диссоциации распадаются на катионы калия и аммония и анион фосфорного остатка. Минеральные соединения используются всеми микроорганизмами, являются источником фосфора, участвующего в синтезе биополимеров в клетках микроорганизмов.

Наиболее важный процесс активного транспорта у культур микроорганизмов - это работа Na/K-насоса, в котором участвуют диссоциированые катионы K⁺-Na⁺ [11].

Результаты микробиологических исследований полученных деструкторов и особенности их метаболизма с использованием в основном модельной сточной воды представлены в таб- лице.

Таблица

Основные пути метаболизма и условия роста

№	Культуры микроорганизмов	Основные пути метаболизма	Продукты реакций	Условия роста
				T ° C	pH	V*
1	Bacillus subtilis (активный ил)	аммонификация белков	СО 2 , NH 3 , H 2 O	35-370С	7,5	6-12 ч
		гидролиз крахмала	декстрины
		гидролиз гликогена	глюкозы
		восстановление нитратов	азот
2	Bacillus mycodies (активный ил)	аммонификация белков	СО 2 , NH 3 , H 2 O	Оптим 30-32°C,	7,0-9,5	9-10 ч
		образование ацетоина	ацетоин
		гидролиз крахмала	декстрины
		редукция нитратов	нитраты, азот
3	Bacillus megaterium (почва)	аммонификация белков	СО 2 , NH 3 , H 2 O	Оптим 30°C 3-45°C	6,5-7,6	6-12 ч
		восстановление нитратов	нитриты
		гидролиз крахмала	декстрины
		гидролитическое отщепление фосфорной кислоты из органических соединений	H 3 PO 4
4	Bacillus licheniformis (почва)	восстановление нитратов	азот	Оптим 37°C	6,5-7,0	6-12 ч
		образование ацетоина	ацетоин
5	Escherichia coli (активный ил)	восстановление сульфатов	сероводород и сера	37°C	6,5-7,6	8 ч
		аммонификация белков белки	СО 2 , NH 3 , H 2 O
		Нитриты и нитраты как акцептор для молекулярного азота
6	Pseudomonas aeruginosa (активный ил)	восстановление нитратов	азот	42°C Оптим 37°C	7,2-7,8	8-12 ч
		окисление глюкозы	глюконовая кислота
		гидролиз белков	аминокислоты
7	Desulfosarcina varia-blis (почва)	восстановление нитритов	аммоний	28-33 °C	6,8-7,0	—
		восстановление сульфатов	сероводород и сера

Продолжение таблицы

№	Культуры микроорганизмов	Основные пути метаболизма	Продукты реакций	Условия роста
				T ° C	pH	V*
8	Desulferella acetivorans (почва)	восстановление нитритов	аммоний	52-57°C	6,8-7,0	—
		восстановление сульфатов	сероводород и сера
9	Thiobacillus denitrifi- cans (почва)	окисление карбоната	СО 2 ,	30-37°C	6,0-9,0 Оптим. 6.85 6,90	9 -36 ч
		окисление серы и сульфида	сульфиты и сульфаты
		Нитриты и нитраты как акцептор для молекулярного азота
10	Nitrosomonas euro-paea (почва)	окисление аммиака	нитриты	20-30°C	6,0-9,0	18 ч
11	Nitrosomonas oli-gotropha (почва)	окисление аммиака	нитриты	20-32°C	6,0-9,0	11-12 ч
12	Nitrosomonas aes-tuarii (почва)	окисление аммиака	нитриты	20-32°C	6,0-9,0	18 ч
13	Nitrobacter alkalicus (почва)	редукция нитратов	нитраты, азот	28-35° С	6,5-7,6	—
		СО 2 как источник углерода
14	Nitrobacter wino-gradskyi (почва)	редукция нитратов	нитраты, азот	30-37° С	6,0-8,6	—
		СО 2 как источник углерода
15	Methanobacterium Thermoautotrophicum (активный ил)	восстановление карбоната	ацетат	35-65 ° С	6,0 до 8,5	—
16	Methylomonas methanic (активный ил)	ассимиляция метана	метанол, формальдегид, муравьиная кислота и СО 2	30°C	6,0 до 8,5	—

Примечание. * - Период развития культуры микроорганизмов.

В результате анализа данных, представленных в таблице, выявлены основные общие условия культивирования микроорганизмов: рН среды 6,0-7,5, температура 35±3 ° С и скорость роста от 6 до 15 ч. Продуктами биохимических реакций и промежуточными метаболитами являются СО 2 , Н 2 О, S ° или H 2 S, N ° или NO 3 ^-, NO 2 ^-, NH 3+ , основной средой обитания выбранных культур является почва и активный ил.

Показано, что в утилизации основных компонентов сточной воды участвует большое количество видов (около 20), осуществляющих многоступенчатые реакции катаболизма, процесс деструкции загрязненных веществ и их метаболитов. Реакция аммонификации и ацетатного брожения наиболее эффективно осуществляют 7 видов бактерий, в том числе 4 вида бацилл. Реакции нитрификации осуществляется тремя видами Nitrosomonas и двумя видами Nitrobacter , возможное участие двух видов сульфатредуцирующих микроорганизмов. В реакции образования метана участвует 1 вид метаногенной бактерии Methanobacterium и ассимиляции метана вид Methylomonas .

Рисунок – Схема утилизации основных компонентов модельной сточной воды предлагаемыми культурами микроорганизмов

В качестве подхода для создания определенного консорциума микроорганизмов для утилизации на примере загрязнителей белковой природы предложена схема (рис.) указанных основных компонентов модельной сточной воды (табл.). Схема основана на результатах исследований биохимических реакций, изучении метаболизма микроорганизмов, активно осуществляющих деструкцию загрязняющих веществ, и условий их роста.

Участие микроорганизмов определяет решающую роль в создании консорциумов. В данном случае в I этапе в первую очередь участвуют культуры микроорганизмов Escherichia coli , Bacillus subtilis и Pseudomonas aeruginosa . Во II этапе - Nitrosomonas europaea, Nitrobacter al-kalicus и Thiobacillus denitrificans . В III этапе принимают участие Pseudomonas aeruginosa . В IV этапе участвуют метаногенные микроорганизмы. Чтобы установить последовательность взаимодействия микроорганизмов требуется проведение опытов. На каждом этапе присутствуют по несколько микроорганизмов, способных заменять друг друга при изменении как внутренних, так и внешних условий.

Компоненты питательной среды используются с разной скоростью. Изменение состава среды под действием биотрансформации микроорганизмов приводит к изменению скорости роста клеток, которая лимитируется самой медленной реакцией консорциума. Эта реакция является «узким местом». В схеме (см. рис.) таким местом является процесс диссимиляционной сульфатредукции сульфатредуцирующими микроорганизмами Desulfosarcina variablis, Desulferella acetivorans и Thiobacillus denitrificans, представленными на II этапе. «Узкое место» в определенных условиях лимитирует общую скорость метаболизма, а иногда и скорость роста размножения клеток. Выявление такого «узкого места» и его контроль чрезвычайно важны для получения максимального выхода биомассы и ценных для человека продуктов метаболизма.

На предложенной схеме (см. рис.) первый этап реакции – аммонификация и ацетатное брожение - осуществляется культурами наиболее активными и распространенными в природе и активном иле Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus mycodies, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Pseudomonas aeruginosa, способные заменять друг друга в процессе биотрансформации компонентов модельной сточной воды, их основной путь метаболизма - аммонификация. Культурами Escherichia coli и Streptococcus thermophilus на первом этапе осуществляется ацетатное брожение. Escherichia coli имеет более высокую устойчивость и выживаемость к разным факторам среды, но при температуре выше 42 ° С не способна активно размножаться, как культура Streptococcus thermophilus, которая используется при более высоких температурах.

Процесс нитрификации осуществляется культурами Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas aestuarii , участвующими в окислении аммиака, и Ni-trobacter alkalicus, Nitrobacter winogradskyi , участвующими в окислении нитрит-аниона до нитрат-аниона, выбранные культуры распространены в активном иле, с высоким содержанием соединений азота, который вырабатывается на первом этапе в процессе аммонификации. Рассмотрим возможность участия во втором этапе сульфатредуцирующих микроорганизмов, Desulfosarcina variabilis; Desulferella acetivorans , участвующих в диссимиляционной суль-фатредукции, используя компонент модельной сточной воды сульфат магния, культуры связаны с восстановлением сульфита. Окисление карбоната осуществляется культурой Thiobacillus denitrificans , способной участвовать в окислении серы, и при возможности использования нитратов и нитритов в качестве акцепторов.

Процесс денитрификации на третьем этапе осуществляется Pseudomonas aeruginosa в анаэробных условиях, на данном этапе культура обладает высокой активностью и способна биотрансформировать различные загрязнители.

В процессе образования метана из ацетата и карбонатов принимают участие культуры Methanobacterium thermoautotrophicum , ассимилируя ацетаты, образуемые в результате реакции (4), и метаногенные бактерии Methanobacterium thermoautotrophicum .

В результате метаболизма соединений модельной сточной воды предлагаемыми микроорганизмами, участвующими в образовании биологической ассоциации, конечными продуктами являются углекислый газ, остатки фосфорной кислоты, сера или сероводород, азот и вода.

Показана возможность создания синтетических консорциумов, основанных на знании метаболизма микроорганизмов, их симбиотических взаимоотношений и типов загрязнителей сточных вод, что позволит наиболее эффективно очищать различные стоки в соответствии с нормативными документами. Культуры микроорганизмов способны потреблять продукты реакций других микроорганизмов, образуя замкнутый цикл, с образованием простых соединений в результате поэтапного действия микроорганизмов. Это позволило разработать схему утилизации основных компонентов модельной сточной воды предлагаемыми культурами микроорганизмов. По правилу 10% (закон Линдемана, или пирамида энергии) с одного этапа в консорциуме может быть передано в среднем 10% количества энергии, поступившей на определенный этап или уровень биоценоза, остальные 80-90% выделяются в виде теплоты. Если в консорциуме передается энергии ниже 10%, он считается неэффективным. Особенностью такого закона для консорциумов является уменьшение численности микроорганизмов при движении от продуцента к консументам.

Предполагается применить разработанную схему (см. рис.) в создании консорциума для очистки сточных вод. На основании разработанной схемы представлены основные рекомендации для создания новых консорциумов:

• 1)    учитывать химический состав сточных вод и природно-климатические условия региона, которые влияют на эффективность биотехнологических процессов;

• 2)    при разработке конкретных технологий по утилизации загрязняющих веществ в сточной воде нужно учитывать условия роста микроорганизмов и их метаболиты ;

• 3)    для их эффективной утилизации необходимо включать в консорциум микроорганизмы, отличающиеся высокой активностью липаз, целлюлаз, карбогидраз и др.;

• 4)    использовать в консорциуме несколько наиболее активные микроорганизмы-деструкторы, что позволит повысить качество биотрансформации сложных соединений (в том числе комплексных) до простых веществ, которые способны усваиваться окружающей средой;

• 5)    необходимо иметь в виду, что в основе схемы лежат биохимические реакции микроорганизмов-деструкторов, с помощью которых осуществляется контроль эффективной биотрансформации, образующих особенности лимитирующих реакций, определяющих важные «узкие места» биотехнологических процессов.

Выводы

• 1.    Выбраны культуры микроорганизмов, такие как Escherichia coli, Bacillus subilis, Bacillus mycodies, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus thermophilus, Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas oligotropha, Nitrosomonas aestuarii, Thiobacillus denitrificans, Desulfosarcina variabilis, Desulferella acetivorans, Nitrobacter alkalicus, Nitrobacter winogradskyi, Methanobacterium thermoautotrophicum , Methylomonas methanica , обладающие активностью к широкому спектру загрязнителей различной химической природы.

• 2.    Для выбора наиболее активных культур, способных утилизировать вышеуказанные загрязнители, на первом этапе исследований целесообразно использовать модельную сточную воду (ГОСТ Р50595-93).

• 3.    На основе результатов исследований условий и основных путей метаболизма предлагаемых культур микроорганизмов, их симбиотических отношений была разработана схема предполагаемых путей утилизации основных загрязнителей модельной сточной воды.

• 4.    В процессе биотрансформации компонентов модельной сточной воды предлагаемыми культурами микроорганизмов конечными продуктами являются аммиак, углекислый газ, остатки фосфорных кислот, нитрит-анион, сера или сероводород, азот, метан и ацетат.

• 5.    На основании изучения загрязнителей сточных вод и основных путей метаболизма, условий роста, симбиотических отношений культур микроорганизмов, обладающих активностью по отношению к определенным группам загрязнителей, можно создавать синтетические консорциумы для решения конкретных задач в области очистки сточных вод водосборной зоны оз. Байкал.

Статья подготовлена при поддержке гранта РФФИ № 18-48-030019 р_а