Метаболизм и хемилюминесцентная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных с разной чувствительностью к ацетилсалициловой кислоте при остром коронарном синдроме

Неспецифическое воспаление при атеросклерозе – одна из причин разрыва покрышки атеромы, атеротромбоза коронарных артерий и острого коронарного синдрома (ОКС) [1]. Нейтрофильные гранулоциты являются ключевыми клетками воспаления. Они первыми мобилизуются в очаг некроза при инфаркте миокарда и служат основным источником свободных радикалов, вызывающих окислительный стресс [2]. Имеются доказательства непосредственного участия нейтрофилов в повреждении миокарда при острой ишемии [3]. Воспринимая многочисленные сигналы о дестабилизации внутренней среды, нейтрофилы модулируют свои функции, нацеленные на ее восстановление. Активированные нейтрофилы сами становятся мощными эффекторами пусковых и регуляторных механизмов каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления.

Функциональная активность нейтрофилов во многом зависит от интенсивности респираторного взрыва и состояния внутриклеточного метаболизма [4, 5]. Однако особенности функциональнометаболических процессов в нейтрофилах при развитии резистентности к АСК у пациентов ОКС до сих пор остаются неизученными.

Цель исследования: изучение особенностей хемилюминесцентного состояния и активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в нейтрофильных гранулоцитах крови у пациентов с разной чувствительностью к АСК при ОКС.

Материалы и методы

В исследование включены 53 пациента (средний возраст 61,1±1,1 лет, 25 мужчин и 28 женщин). Критериями включения в исследование являлись: ОКС у пациентов обоего пола, в возрасте от 35 до 75 лет, в первые 24 часа поступления в стационар от начала заболевания, не принимавших до госпитализации антиагреганты и антикоагулянты, и подписавших информированное согласие. Диагноз ОКС, а в дальнейшем острого инфаркта миокарда с элевацией или депрессией сегмента ST и положительным тропонином T устанавливался в соответствии с критериями Европейского общества кардиологов [6]. Критерии исключения: сопутствующий сахарный диабет, тяжелая сопутствующая патология (почечная недостаточность, последствия инсульта), сердечная недостаточность III стадии, кардиогенный шок при поступлении в стационар, отсутствие информированного согласия. Всем пациентам была проведена реперфузи- онная терапия в виде чрескожного коронарного вмешательства или тромболитической терапии. В дальнейшем пациенты получали терапию антитромбоцитарными препаратами (АСК, клопидогрел), β-адреноблокаторами, ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента, статинами. Контрольная группа сформирована из 50 относительно здоровых добровольцев без сердечно-сосудистых заболеваний (все испытуемые были обследованы на наличие сердечнососудистых заболеваний), сопоставимых по полу и возрасту (средний возраст 56,9±1,4 года, 27 мужчин и 23 женщины).

Все пациенты до начала лечения и реваскуляризации были обследованы на резистентность к АСК и, соответственно, разделены на группы чувствительных (АЧ) и резистентных к АСК (АР). Оценка резистентности/чувствительно-сти к АСК осуществлялась in vitro путем последовательного инкубирования обогащенной тромбоцитами плазмы с 5 мкМ аденозиндифосфата (АДФ) и 3,36 мМ АСК и определения уровня агрегации тромбоцитов после каждого инкубирования. Сущность определения заключалась в том, что у больных до начала терапии АСК исследовали АДФ-индуцированную и АСК-зависимую агрегации тромбоцитов и по их разнице определяли величину коэффициента ингибирования агрегации (КИА), величина КИА<24% свидетельствует о резистентности к АСК, при КИА ≥24% – о чувствительности к АСК [7].

Нейтрофилы выделяли из цельной гепаринизированной крови центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см3 – для отделения лимфоцитов; ρ=1,119 г/см3 – для выделения нейтрофилов. Состояние респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов исследовали с помощью хемилюминесцентного анализа [8]. В качестве индикаторов хемилюминесценции использовали люминол и люцигенин. Оценка спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции осуществлялась в течение 90 минут на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе “CL3606” (Россия). Определяли следующие характеристики: время выхода на максимум (Тmax), максимальное значение интенсивности (Imax), а также площадь под кривой (S) хемилюминесценции. Усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, оценивали отношением площади индуцированной хемилюминесценции (Sинд.) к площади спонтанной (Sспонт.) и определяли как индекс активации (Sинд./Sспонт.).

Исследование активности НАД(Ф)-зави-симых дегидрогеназ в нейтрофилах проводили с помощью биолюминесцентного метода [9]. Метаболизм клеток оценивали по активности следующих ферментов: глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фос-фатдегидрогеназы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДН-ГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАД-ФИЦДГ, соответственно) и глутатионредук-тазы (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 клеток, где 1 Е = 1 мкмоль/мин [10]. Исследование проводили на ферментативном препарате NАD(Р): FMNоксидоредуктаза-люцифераза из Photobacterium leiognathi (получен в ФГБНУ «НИИ биофизики», Красноярск).

Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения науч- ных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартального размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75, соответственно). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по Mann-Whitney U test. Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft Inc., 2004).

Результаты исследования

При исследовании люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов обнаружено снижение площади под кривой спонтанной хемилюминесценции у АР пациентов относительно показателей, выявленных у АЧ пациентов при ОКС (табл. 1). Также у АР пациентов снижена площадь под кривой зимозан-индуцированной люцигенин-зависимой хемилюминесценции как относительно контрольного диапазона, так и значений, выявленных у АЧ пациентов. Особенностями люцигенин-зависимой хемилюминесценции у АЧ пациентов является сокращение времени

Таблица 1