Методика определения тетрациклиновой группы в томатах

Антибиотики оказывают огромное влияние на нашу жизнь прямым и косвенным образом, исключить их применение не представляется возможным. Присутствие антибиотиков в окружающей среде даже в низких концентрациях представляет значительную экологическую проблему, которая оказывает негативное влияние на здоровье человека и животных [1-3]. При проведении мониторинга окружающей среды остатки антибиотиков обнаруживаются в сточных водах, в иле, переваренном осадке и твердых биоматериалах. Сельскохозяйственная почва и грунтовые воды служат двумя основными резервуарами остаточных количеств антибиотиков, по причине адсорбирования почвой, могут попадать в поверхностные и грунтовые воды [2].

Тетрациклиновая группа антибиотиков является одной из наиболее широко используемой в ветеринарии, животноводческой и птицеводческой отрасли сельского хозяйства. К антибиотикам этой группы относятся тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин, хлортетрациклин и демеклоциклин. Для всех тетрациклинов характерен широкий спектр антимикробного действия, проявляющийся в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, штаммов хламидий, микоплазм и риккетсий, простейших паразитов [1].

Антибиотики тетрациклиновой группы обладают значительным минусом, так как накапливаются в окружающей среде: почве, водоемах и сельскохозяйственных угодьях [4, 8].

Также применение антибактериальных препаратов, в том числе тетрациклиновой группы, приводит к нарушению работы микрофлоры кишечника и эндокринным заболеваниям. Живой организм теряет способность самостоятельно противостоять различным инфекциям и, кроме того, их широкое применение привело к тому, что появляются новые антибиотикорезистентные штаммы бактерий [5, 6].

Загрязнение антибиотиками овощей и фруктов возможно из-за нарушения технологии животноводства и санитарных норм, когда отходы с животноводческих и птицеводческих ферм утилизируются неправильно или органические отходы (навоз и помет) применяются в качестве удобрений, что ведет к загрязнению почв и грунтовых вод, и, как следствие, к попадаю остаточных количеств антибактериальных препаратов в растительную продукцию и корма для животных [7].

Возникает острая необходимость в мониторинге остатков антибиотиков не только в продукции животного происхождения, кормов и полуфабрикатов, но и плодовоовощной продукции [9].

Материал и методы исследований. При проведении научных испытаний авторы работы исследовали томаты 5 сортов по 1 кг каждый, приобретенные на продовольственных рынках города Москвы и Подмосковья. Опыты проводились на базе ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Москва.

Испытательное оборудование: высокоэффективный жидкостный хроматограф масс селективным детектором LCMS-8060 Shimadzu (Япония).

Вспомогательное оборудование: напольная центрифуга Thermo Scientific SL40R, нагревательный модуль Thermo 18821, весы неавтоматического действия Secura 225D-1ORU, дозаторы механические 1-канальные «Biohit»

переменного объема.

Химические           реактивы:

ацетонитрил HPLC, метанол  HPLC, муравьиная кислота ОСЧ.

Стандартные образцы антибиотиков: тетрациклина, окситетрациклина, доксициклина, хлортетрациклина и демеклоциклин (фирма Sigma-Aldrich).

Результат исследований. С целью определения остатков антибиотиков тетрациклиновой группы в данном научном исследовании было исследовано 5 образцов томатов с внесением в испытуемую пробу стандартного образца тетрациклиновой группы (50 мкг/кг).

Образец томата измельчали, вносили навеску 2,0 в пробирки на 50 см3, добавляли стандартные образцы антибиотиков объемом 100 мкл с концентрацией 1000 нг/мл. В качестве внутреннего стандарта извлечения дополнительно добавляли раствор демеклоциклина объемом 100 мкл в метаноле. Затем готовили буферный раствор с последующим добавлением к пробе, закрывали крышкой, интенсивно перемешивали.

Далее виалы с образцами помещали в центрифугу и центрифугировали в течение 20 мин. Процедуру экстракции и центрифугирование повторяли. Экстракты собирали в чистые виалы. В дальнейшем проводили твердофазную экстракцию.

В качестве подвижной фазы А и В готовили 0,1% растворы муравьиной кислоты и 0,1% раствор муравьиной кислоты в метаноле, соответственно. Для каждого антибиотика тетрациклиновой группы измеряли сигнал для двух фрагментных ионов, согласно таблице 1.

Таблица 1 – Значения масс ионов-предшественников и ионов-фрагментов

Антибиотик тетрациклиновой группы	Ион-предшественник, m/z <*>	Ионы-фрагменты, m/z <*>
Тетрациклин	445,1	410
		427,1
Окситетрациклин	461,1	426,1
		444,2
Доксициклин	445,1	428
		410
Хлортетрациклин	479,1	444,1
		462,1
Демеклоциклин	465,1	448,1
		430,1
<*> m/z – отношение массы иона к его заряду

Время удерживания тетрациклиновой группы определяют при анализе градуировочных растворов. Расчеты содержания тетрациклиновой группы выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров, поставляемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем, для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. На рисунке 1 представлены хроматограммы стандарта доксициклина.

St1

St2

St3

St4

Cone 11,6701

Area 466721

R#1 445,201410,20 7,27(0,00)

Q 445,201428,20 (+)       3,80e4

Cone 52,7207

Area 2352420

R#1 445,20 >410,20 6,80(0,00)

Q 445,201428,20 (+)       1,95e5

Cone 95,7885

Area 4859892

R#1 445,20 1 410,20 6,58 (0,00)

Q 445,201428,20 (+)       4,07e5

Рисунок 1 – Хроматограммы стандарта доксициклина

Cone 0,8207

Area 57074

R#1 445,201410,20 6,26 (0,00)

Q 445,201428,20 (+)       4,65e3

Помидор 2

Cone 99,3975

Area 19592554

R#1 445,20 >410,20 2,38 (0,00)

Помидор 3

Cone 95,6899

Area 20175951

R#1 445,20>410,20 0,99 (0,00)

Помидор_1

Cone 95,8372

Area 16239627

R#1 445,20> 410,20 1,03 (0,00)

Помидор_5

СОПС 108,0921

Area 22103778

R#1 445,20>410,20 6,82 (0,00)

Помидор 4

Cone 106,5352

Area 20662827

R#1 445,20>410,20 2,96 (0,00)

Рисунок 2 – Хроматограммы доксициклина в испытуемых образцах томатов с добавкой

Таблица 2 – Результаты обнаружения тетрациклиновой группы в образцах томатов

Антибиотик тетрациклиновой группы	Степень извлечения антибиотиков тетрациклиновой групп, %
	Томат 1	Томат 2	Томат 3	Томат 4	Томат 5
Тетрациклин	91,4	95,3	97,2	102,3	94,3
Окситетрациклин	94,7	96,1	89,9	98,6	98,2
Доксициклин	95,8	99,4	95,2	106,4	108,1
Хлортетрациклин	89,6	101,9	95,2	102,9	95,6

Представлены хроматограммы доксициклина в испытуемых образцах томатов с добавкой (Рисунок 2), время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора соответствует времени удерживания доксициклина на хроматограмме стандартного образца.

Результаты опытов обнаружения антибиотиков тетрациклиновой группы (тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин и хлортетрациклин) в томатах представлены в таблице 2.

Как видно из данных таблицы 2, погрешность в определении искомых веществ составила около 10 %, что является допустимым значением. Методика пробоподготовки, использованная в данном научном исследовании, и дальнейшее обнаружение остатков тетрациклинов в томатах, с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием является одним из наиболее чувствительных и селективных методов с целью определения примесей органических веществ в пищевой продукции.

Заключение. В современное время на территории Российской Федерации не осуществляется в полной мере контроль за содержание тетрациклиновой группы в плодовоовощной продукции. Поэтому определение остаточных количеств антибиотиков в овощах является актуальной и важной задачей для обеспечения пищевой безопасности.

В своем научном исследовании мы представили результаты собственных исследований по методике, разработанной авторским коллективом для определения антибиотиков тетрациклиновой группы в овощах – а именно в томатах. Предложенная методика обнаружения ветеринарных препаратов в томатах методом ВЭЖХ МС/МС позволит повысить уровень контроля качества проверяемой продукции и ее безопасность для потребителя.

Таким образом, необходим мониторинг продуктов животного и растительного происхождения, почвы и воды, в отношении присутствия в них остаточных количеств антибактериальных препаратов, а также углубленное изучение поставленного вопроса.