Межпоколенная динамика репродуктивных нарушений у Daphnia magna при хроническом воздействии гербицидов: выделение трех типов ответа

Гербициды являются значимым источником антропогенной нагрузки на поверхностные воды, они поступают в водоемы с поверхностным стоком, при инфильтрации и атмосферном переносе, а их воздействие определяется концентрацией, продолжи- тельностью экспозиции и гидрохимическими условиями (Волгина и др., 2010; Ки-рейчева, Лентяева, 2020; Stevanovic, Gašić, 2020). Для водных экосистем важны не только летальные, но и сублетальные эффекты, поскольку снижение репродуктивной продукции может изменять численность по- пуляций быстрее, чем возникает заметная смертность.

Зоопланктон особенно информативен для оценки хронического воздействия. Дафнии занимают ключевое положение в трофических цепях пресных водоемов, а их короткий жизненный цикл позволяет регистрировать изменения репродукции в нескольких поколениях (Ebert, 2022). Исследования показывают, что агрохимикаты способны изменять биомассу и структуру сообществ зоопланктона, а хронические эффекты могут существенно различаться между таксонами (Горбатов и др., 2019; Hébert et al., 2021; Ghosh et al., 2023; Klátyik et al., 2024).

Метрибузин (действующее вещество гербицида Зино) активно применяется в сельском хозяйстве на территории РФ, гербицид в основном используется для защиты томата и пшеницы (Байрамбеков и др., 2011; Голубев, Долженко, 2020). Трифлу-ралин (действующее вещество гербицида Анонс) является достаточно популярным, используемым во всем мире динитроанилиновым гербицидом, благодаря низкой цене применяется для хлопчатника, пшеницы и масличных культур (Zhang et al., 2023; Ni et al., 2025). Реглон (действующее вещество дикват) эффективен против однолетних двудольных и злаковых сорняков, препарат действует контактно и приводит к усыханию и гибели сорных растений. Препарат также активно применяется как десикант для ис-куственного подсушивания растений перед уборкой (Москвичев, Агапова, 2022). Базис (римсульфурон + тифенсульфуронметил), как правило, достаточно активно используется в посевах кукурузы на территории РФ (Накаева, 2024; Накаева и др., 2023). Лон-трел (клопиралид) применяется в основном для зерновых культур, сахарной свеклы, льна-долгунца и рапса, как правило, против осота и бодяка (Голубев, Берестецкий, 2021).

Стандартный хронический тест Daphnia magna обычно оценивает один репродуктивный цикл. Такой подход позволяет определить LOEC и NOEC, но не показывает, изменяется ли чувствительность потомков при продолжительном воздействии. Межпоколенный анализ особенно важен для веществ, способных вызывать отсроченные или нелинейные эффекты.

Цель исследования – установить закономерности межпоколенной динамики репродуктивных нарушений и выделить типы ответа, различающиеся по направленности изменения эффекта от P к F3.

Материалы

Объектом исследования служила Daphnia magna Straus. Для хронических испытаний отбирали одновозрастных самок в возрасте не более 24 ч. Исследовали пять препаратов различных химических классов: Зино с.п. (метрибузин), Анонс к.э. (трифлуралин), Реглон Форте ВР (дикват), Базис СТС (рим-сульфурон + тифенсульфуронметил) и Лон-трел-300 ВР (клопиралид) (Государственный каталог…, 2025).

Хронические опыты проводили в лабораторных условиях при температуре 18–22 °C и фотопериоде 16 ч света и 8 ч темноты. Использовали отстоянную дехлорированную водопроводную воду и природную фильтрованную воду олиготрофного водоема. Концентрации в хронических опытах составляли: для Зино 0.00001–2.5 мг/л, Анонса 0.0005–1.0 мг/л, Реглона 0.0013–6.5 мг/л, Базиса 0.1–500 мг/л и Лонтрела 10–250 мг/л. Большой разброс используемых концентраций обусловлен разными типами межпоколенной динамики и несовпадением порогов хронического воздействия. Все гербициды различаются по токсичности, т. к. относятся к разным классам. Каждый вариант, включая контроль, испытывали в трех повторностях по 10 одновозрастных самок в каждой (всего 30 особей на концентрацию).

Специальный учет самцов и половой структуры популяции в протокол не входил, все репродуктивные показатели регистрировали для партеногенетических самок. В каждом эксперименте использовали два варианта контроля: чистый контроль (культивационная среда без гербицида и растворителя) и контроль растворителя (среда с растворителем в концентрации, соответствующей максимальной в опытных вариантах). При отсутствии статистически значимых различий между ними данные объединяли и сравнивали с общим контролем; при наличии различий все расчеты LOEC/NOEC проводили относительно контроля растворителя. Это позволяет отделить действие гербицида от влияния носителя, что особенно важно для плохо растворимых соединений, таких как трифлуралин.

Наблюдение проводили в исходном поколении P и трех последовательных поколениях F1, F2 и F3. Продолжительность отдельных хронических экспериментов составляла 21–30 суток. Дафний ежедневно кормили суспензией Chlorella sp. и гидролизных дрожжей.

Методы

Хронические опыты проводили в соответствии с ГОСТ 32367-2020. В хронических опытах растворы обновляли в полустатиче-ском режиме с учетом стабильности каждого препарата. Достоверность испытаний контролировали по требованиям к контрольной смертности, репродуктивной продукции и коэффициенту вариации. ГОСТ 32367-2020 ограничен оценкой токсичности за один цикл родительского поколения, что недостаточно для веществ с кумулятивными или эпигенетическими эффектами. Поэтому разработана схема с наблюдением в поколениях P–F3, позволяющая выявить отдаленные последствия, не проявляющиеся в стандартном 21-дневном тесте. Наибольшую информативность экспериментов показывает не только наличие четырех поколений, но и разнообразие классов гербицидных препаратов.

Регистрировали выживаемость родительских особей, день наступления половозре-лости, день первого помета, число пометов и реальную плодовитость. Реальную плодовитость определяли как количество выжившей молоди, произведенной одной родительской особью за период наблюдения. LOEC определяли как минимальную концентрацию со статистически значимым отличием от контроля, NOEC – как максимальную концентрацию без такого отличия. NOEC – No Observed Effect Concentration – наибольшая испытанная концентрация, при которой не наблюдается статистически значимого эффекта по сравнению с контролем. LOEC – Lowest Observed Effect Concentration – наименьшая испытанная концентрация, при которой наблюдается статистически значимый эффект по сравнению с контролем.

Для выявления статистически значимых отличий между опытными и контрольными группами в пределах одного поколения применяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок. При множественных сравнениях (по концентрациям) использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим критерием Даннетта, а для межпоколенных попарных сравнений одной и той же концентрации – t-критерий с поправкой Бонферрони. Перед параметрическими тестами проверяли нормальность распределения (критерий Шапиро – Уилка) и однородность дисперсий (критерий Левене). В случаях нарушения этих условий применяли непараметрический

U-критерий Манна – Уитни. Различия считали достоверными при p < 0.05.

Результаты

Одним из важнейших результатов исследования является то, что во всех пяти сериях экспериментов фактическая плодовитость оказалась наиболее чувствительным показателем. Например, для метрибузина пороговая концентрация по плодовитости в F2–F3 составляла 0.00005 мг/л, тогда как достоверное снижение выживаемости наблюдалось лишь при 0.001 мг/л (т. е. в 20 раз выше). Для диквата в F1 при 0.013 мг/л плодовитость снижалась на 10.8 %, а выживаемость оставалась на уровне контроля (100 %). Аналогичное соотношение зафиксировано для всех исследованных веществ. Межпоколенная динамика реальной плодовитости представлена на рисунке. Данные даны как средние; стандартные ошибки не превышали 5 % от среднего ( n = 3 ).

Анализ четырех поколений D. magna (P– F3) показал, что хроническое действие гербицидов не ограничивается дозозависимым снижением плодовитости, а характеризуется тремя устойчивыми типами межпоколенной динамики.

Первый тип – прогрессирующее усиление токсичности (Зино, Базис, Лонтрел): уменьшение пороговой концентрации (LOEC) и нарастание угнетения плодовитости к F3, что, в свою очередь, сопровождается задержкой развития и сокращением числа пометов. Эти данные явно указывают на накопление повреждений или эпигенетические изменения, поэтому четыре поколения для тестирования обязательны. Для метрибузина при концентрации 0.00005 мг/л в исходном поколении (P) реальная плодовитость составила 92.5 ± 2.75 (94.8 % от контроля, p > 0.05), в F1 – 90.9 ± 2.34 (94.2 %, p > 0.05), однако в F2 она снизилась до 76.8 ± 2.63 (81.9 %, p < 0.05), а в F3 - до 71.6 ± 2.30 (81.1 %, p < 0.05). Таким образом, LOEC по этому показателю уменьшилась с 0.00025 мг/л (в P и F1) до 0.00005 мг/л (в F2 и F3). Для смеси сульфонилмочевин (Базис) при концентрации 100 мг/л плодовитость в P составляла 81.2 ± 2.8 (81.2 %), в F1 – 78.0 ± 3.0 (78.0 %), в F2 – 73.0 ± 2.9 (73.0 %), в F3 – 68.2 ± 2.7 (68.2 %). Для клопиралида (Лонтрел) при 150 мг/л: P – 80.4±2.5 (67.0 %), F1 – 74.4 ± 2.3 (63.1 %), F2 – 68.4 ± 2.1 (59.0 %), F3 – 61.2 ± 2.0 (53.7 %). Во всех случаях различия достоверны при p < 0.05. Сопутствующие эффекты: задержка развития на 1–2 дня, уменьшение числа пометов.

Эффективные концентрации гербицидов в ряде поколений Daphnia magna: 1 - исходное (родительское) поколение; 2 – первое дочернее поколение;3 – второе дочернее поколение; 4 – третье дочернее поколение

Effective herbicide concentrations in successive generations of Daphnia magna: 1 – parental generation; 2 – first filial generation; 3 – second filial generation; 4 – third filial generation

Второй тип - двухфазная реакция с временной стимуляцией (Реглон): в F1 - угнетение, в F2 – стимуляция плодовитости (на 8–11 %), в F3 – повторное снижение. Эффект маскирует хроническую опасность, создавая ложное впечатление безопасности в F2, поэтому эксперимент необходимо продлевать до F3. При концентрации 0.013 мг/л реальная плодовитость в F1 составила 123.1 ± 3.5 (89.2 % от контроля, p < 0.05), в F2 – 149.7 ± 4.1 (110.9 %, p < 0.05), а в F3 - 117.5 ± 3.3 (89.0 %, p < 0.05). При 0.0013 мг/л в F1 – 138.0 ± 3.4 (100 %, p > 0.05), в F2 – 145.8 ± 3.9 (108.0 %, p < 0.05), в F3 – 110.9 ± 2.7 (84.0 %, p < 0.05). Эти результаты показывают, что временное восстановление неустойчиво и при завершении теста на F2 можно ошибочно подумать о безопасности.

Третий тип – адаптивная стабилизация или ослабление (Анонс): эффект снижается в поколениях, порог повышается к F3, что говорит о включении защитных механизмов. Для этих веществ достаточно стандартного 21-суточного теста. При концентрации 0.001 мг/л реальная плодовитость составляла в P – 129.0 ± 2.8 (87.2 % от контроля, p > 0.05), в F1 – 117.0 ± 2.7 (81.8 %, p < 0.05), в F2 – 112.0 ± 2.9 (80.6 %, p < 0.05), в F3 – 107.0 ± 3.1 (79 3 %, p > 0.05). При этом LOEC в P составляла 0.005

мг/л, в F1 и F2 – 0.001 мг/л, а в F3 – снова 0.005 мг/л, т. е. порог в третьем поколении повысился, что указывает на ослабление эффекта, а это, в свою очередь, свидетельствует о включении защитных механизмов и возможном отсутствии кумуляции.

Все значения в тексте представлены как среднее ± стандартная ошибка ( n = 3). Различия считали достоверными при p < 0.05.

При более ранних исследованиях острая токсичность гербицидов (ЛК₅₀ за 48 ч) составила: для метрибузина - 0.10 мг/л, триф-луралина – 2.50 мг/л, диквата – 13.0 мг/л, клопиралида - 220.5 мг/л, сульфонилмо-чевин – 1245.0 мг/л. Разрыв между острой и хронической токсичностью достигает 3–4 порядков, что подтверждает необходимость многопоколенного тестирования.

Обсуждение

Сопоставление четырех поколений показывает, что хронический ответ D. magna имеет временную структуру. Одна и та же концентрация может быть недействующей в P, угнетающей в F1, стимулирующей в F2 и снова угнетающей в F3. Поэтому однопоколенная не всегда может быть применима, т. к. недостаточно отражает хроническое воздействие. Тем не менее опыты на трех поколениях дафний описаны в Приказе Росрыбо- ловства № 695. При коротких опытах (1–3-е поколения) не всегда видны скрытые нарушения. Например, во втором поколении дафнии могут начать размножаться лучше, чем в контроле, что создаст ложное впечатление, т. к. в третьем поколении размножение снова упало. В итоге методика позволяет предсказывать долгосрочный риск для популяций и определять, для каких веществ обязательны четырехпоколенные испытания, тогда как Приказ № 695 дает только формальный порог ПДК без учета сложной динамики. ГОСТ 32367-2020 предписывает использование только одного поколения и не дает углубленной экологической оценки, а также ранжирования веществ по типу хронического воздействия.

При длительном воздействии даже малые концентрации гербицида могут нарушать размножение D. magna и передавать эти нарушения потомкам, даже если родительские особи внешне здоровы. В поколении P уже регистрируются достоверные изменения: снижение общей плодовитости, размера кладок, числа пометов за жизнь, а также возможная задержка достижения половой зрелости (Папченкова, 2024; Папчен-кова и др., 2009).

В первый тип попали метрибузин, сульфо-нилмочевины и клопиралид. У метрибузина в поздних поколениях снижалась LOEC. У Базиса и Лонтрела при той же концентрации эффект становился глубже. Такая динамика похожа на накопление действия, но в данной работе не изучались механизмы, например, возможные герминативные или эпигенетические эффекты.

Второй тип, установленный для диквата, показывает, насколько важно исследовать четыре поколения. Стимуляция в F2 могла бы быть ошибочно принята за восстановление репродукции, если наблюдение завершалось до F3. Подобные нелинейные реакции требуют осторожной интерпретации и продолженного наблюдения.

Третий тип, характерный для трифлурали-на, связан с ослаблением эффекта в F3, что означает отсутствие межпоколенного усиления при исследованных условиях.

Следует отметить, что в контрольных группах наблюдалось закономерное снижение реальной плодовитости от поколения P к F3 (например, для Анонса – с 148.0 ± 2.6 до 135.0 ± 2.0, для реглона – с 140.0 ± 3.5 до 132.0 ± 2.8). Это явление, вероятно, связано с материнским эффектом, накоплением возрастных изменений в культуре или незначи- тельным инбридингом. Однако все сравнения проводились относительно контроля соответствующего поколения, поэтому данное снижение не влияет на оценку токсического эффекта, а лишь подчеркивает необходимость строгого учета поколенческого фона при межпоколенных тестах.

Сопоставление пороговых концентраций по плодовитости с действующими рыбохозяйственными ПДК показывает, что для ме-трибузина LOEC (0.00005 мг/л) на два-три порядка ниже установленного норматива (0.1 мг/л), тогда как для трифлуралина, диквата, сульфонилмочевин и клопиралида LOEC превышает ПДК в 3–2500 раз. Это означает, что для метрибузина многопоколенный тест выявляет эффекты при концентрациях, которые формально считаются безопасными, а для остальных гербицидов при концентрациях, превышающих нормативные. Такое расхождение подчеркивает необходимость пересмотра подходов к нормированию с учетом межпоколенных эффектов.

Полученные результаты согласуются с общим представлением о том, что хроническая токсичность агрохимикатов для водных организмов может проявляться на сублетальном уровне и различаться между компонентами сообществ (Горбатов и др., 2019; Халиков, 2019; Hébert et al., 2021; Klátyik et al., 2024).

Заключение

При сравнении динамики плодовитости в четырех поколениях сразу было замечено, что вещества ведут себя принципиально по-разному, соответственно выделено три устойчивых типа межпоколенной динамики репродуктивных нарушений у D. magna при хроническом воздействии гербицидов. Первый тип (прогрессирующее усиление эффекта) выявлен для метрибузина, суль-фонилмочевин и клопиралида. Второй тип (нелинейная двухфазная реакция с промежуточной стимуляцией) характерен для диквата. Третий тип (ослабление эффекта без межпоколенного усиления) установлен для трифлуралина. Самым информативным показателем оказалась фактическая плодовитость. Исследование только реакции одного поколения для веществ первого и второго типов может приводить к недостаточной токсикологической оценке или искажению хронического риска. Благодаря межпоколенному тесту возможно прогнозирование хронических эффектов на популяции, что, в свою очередь, может определять воздействие на экосистемы.