Микобактериальные антигены: синтетические пептиды и рекомбинантные белки

При туберкулезной инфекции немаловажное значение имеет изучение гуморального иммунного ответа, а использование рекомбинантных антигенов и синтетических пептидов их эпитопов позволит усовершенствовать методы диагностики и мониторинга патогенеза инфицированных животных и человека. Одним из наиболее эффективных методов для этих целей является предлагаемый нами мультиплексный иммуноанализ, позволяющий проводить скрининг к нескольким антигенам одновременно, с последующей комбинированной интерпретацией результатов [1].

Нами изучен ряд микобактериальных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами. Полученные результаты, опубликованные нами ранее, показали высокую специфичность и чувствительность мультиплексного хемилюминесцентного анализа с применением микобактериальных антигенов при диагностике туберкулеза у разных видов животных, в том числе и для дифференциации инфицирования патогенным возбудителем от природных изолятов микобактерий [2, 3, 4]. Мультиплексный вариант иммуноанализа подразумевает использование различных антигенов, которые вступают в иммунологические реакции со специфическими антителами, продуцируемые на различных этапах развития патогенеза туберкулеза. При экспериментальном заражении животных микобактериями туберкулеза с последующим исследованием динамики постинфекционного антителогенеза доказано, что такие биомаркеры как ESAT-6, CFP-10 обнаруживаются на ранних стадиях инфекции, в то время как MPB70 и MPB83 – на более поздних. Используя методы биоинформатики и генной инженерии были получены рекомбинантные белки-аналоги указанных белковых антигенов возбудителя туберкулеза. Рекомбинантные антигены использовали для сенсибилизации планшет мультиплексной тест-системы с целью создания набора диагностикумов для индикации инфицирования животных патогенными микобактериями.

На рисунке 1 представлены результаты, полученные после экспериментального заражения вапити (Cervus elaphus nelsoni), подвида благородного оленя, полевым штаммом M.bovis, выделенным из коровы в провинции Манитоба, Канада. Антителогенез к отдельным микобактериальным антигенам проявлялся в различные сроки постинфекционного патогенеза, при этом уровень антител в сыворотке крови животного оставался на высоком уровне до конца сроков наблюдения (более 6 месяцев). Подробные результаты данного исследования будут представлены в наших дальнейших публикациях.

Для диагностики, и в особенности для изучения патогенеза, вызванного микобактериями, целесообразно использовать несколько биомаркеров, которые следует включать в тест-систему в виде рекомбинантных антигенов. Помимо вышеуказанных, предлагается использовать биомаркеры свойственные разным видам микобактерий, позволяющие прослеживать ход развития инфекционного процесса, такие

Рис. 1. Антителогенез у вапити, экспериментально зараженного M.bovis .

Еще одним направлением в создании диагностикумов нового поколения являются синтетические пептиды. Используя методы биоинформатики нами были выявлены по 2-6 иммунных эпитопа микобактериальных антигенов Rv3616c, ESAT-6, CFP-10, MPB70 и MPB83, пептиды которых были синтезированы. Пептидные последовательности аминокислот некоторых из указанных антигенов представлены в рисунке 2. Результаты исследований показали, что разные виды животных по-разному реагируют на отдельные эпитопы микобактериальных антигенов. В связи с этим мультиплексный иммуноанализ, позволяющий использовать несколько аналитов одновременно, является наиболее эффективным для диагностики и изучения патогенеза с использованием как пептидов, так и рекомбинантных антигенов.

Полученные данные коррелируют с исследованиями других ученых.

При постановке кожной аллергической пробы рекомендуется заменить широко используемый и не поддающийся стандартизации туберкулин на смесь рекомбинантных белков и пептидов антигенов ESAT-6, CFP-10 и Rv-3615c M.tuberculosis [6]. Антиген 16 kDa HSP M.tuberculosis предлагается использовать для производства новых диагностических моноклональных антител, основанных на мультиплексном подходе [8]. Мультиантигенный принт-иммуноанализ с использованием нескольких специфичных туберкулезных антигенов показал высокую диагностическую эффективность [7]. Иммуноблот анализ сывороток крови на выявление фракции 60 kDa в ДМСО-антигене M.bovis может служить диагностическим тестом при туберкулезе у крупного рогатого скота [5].

SEQ ID NO: 4 - residues 1-34 of Rv3616c:

MSRAFIIDPTISAIDGLYDLLGIGIPNQGGILYS

SEQ ID NO: 7 - PEP1(MPB7O):

KGSGSSVQGMSQDPVAVAASNNPEL

SEQ ID NO: 12 - PEP9 (CFP10)

KGSGS NIRQAGVQYSRADEEQQQ

SEQ ID NO: 9 - Rv3875 (ESAT6):

TEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQG

VQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA

Рис. 2. Последовательность аминокислот синтетических микобактериальных пептидных антигенов

Постановка диагноза при туберкулезе в современных условиях требует комплексного подхода с учетом эпидемических, клинических, иммунологических и рентгенологических данных, что позволит предотвратить развитие осложненных и генерализованных форм заболевания. Использование мультиплексного иммуноанализа сывороток крови с применением различных рекомбинантных антигенов и синтетических пептидов позволит организовать высокоэффективную диагностику, способ изучения патогенеза в организме зараженного человека, будет способствовать успешному проведению скрининговых исследований для контроля распространения туберкулеза.

ЛИТЕРАТУРА:    1.    Шуралев    Э.А.    Мультиплексная иммуноферментная хемилюминесцентная тест-платформа для индикации биопатогенов в организмах // Народное хозяйство. Вопросы инновационного развития. – 2012. - № 1. – С. 258-261. 2. Шуралев Э.А. Сравнительный анализ тест-систем для диагностики туберкулеза у альпак // Ветеринарный врач. – 2012. – №5. – С.30-33. 3. Шуралев Э.А., Мукминов М.Н., Валеева А.Р. и др. Оценка специфичности антигенов для диагностики туберкулеза кабана // Ветеринария. – 2013. – №2. – С.25-28. 4. Шуралев Э.А., Ндайишимийе Э.В., Мукминов М.Н. К вопросу серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Ученые записки КГАВМ им.Н.Э.Баумана. – 2012. – Т.211. – С.202-206. 5. Якупов Т.Р., Хаертдинов К.С. Иммуноблот анализ в диагностике туберкулеза. // Ветеринарный врач. – 2011. – №1. – С.29-31. 6. Casal C., Bezos J., Díez-Guerrier A., et al. Evaluation of two cocktails containing ESAT-6, CFP-10 and Rv-3615c in the intradermal test and the interferon-γ assay for diagnosis of bovine tuberculosis. // Prev Vet Med. – 2012. – V.105, №1-2. – P.149-154. 7. Ireton G.C., Greenwald R., Liang H., et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis antigens of high serodiagnostic value. // Clin Vaccine Immunol. – 2010. – V.17, №10. – P.1539-1547. 8. Trilling A.K., de Ronde H., Noteboom L., et al. A broad set of different llama antibodies specific for a 16 kDa heat shock protein of Mycobacterium tuberculosis. // PLoS One. – 2011. – V.6, №10. – e26754.

МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫЕ АНТИГЕНЫ: СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ И РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ

Шуралев Э.А.

Резюме

В данной работе обобщены полученные нами результаты испытаний мультиплексного иммуноанализа с применением рекомбинантных антигенов и синтетических пептидов для диагностики туберкулеза животных. Указывается потенциальная возможность применения метода для контроля распространения и изучения патогенеза туберкулеза.

MYCOBACTERIAL ANTIGENS: SYNTHETIC PEPTIDES AND RECOMBINANT PROTEINS

Shuralev E.A.