Микотоксины в кофе и цикории: от регламентируемых к эмерджентным

Одним из наиболее часто употребляемых натуральных напитков в мире является кофе. На его долю приходится 75 % от потребления безалкогольных напитков [1]. В Российской Федерации в 2019 г. потребление кофе на 12 % превысило потребление чая. Самыми распространенными сортами кофе являются арабика (Coffea arabica) и робуста (Coffea canephora var. Robusta) [2]. Кроме них известно еще 125 сортов кофе, в частности, либе-рика (Coffea liberica, Coffea excelsa), выращиваемый в Юго-Восточной Азии и известный своим горьким вкусом, эужениоидис (Coffea eugenioides), произрастающий в Эфиопии, и камерунский (Coffea charrieriana), выращиваемый в Камеруне [3]. В последние годы были отмечены полезные свойства зеленого кофе, что привело к увеличению потребления напитков на его основе [4]. В качестве альтернативы кофе выступает цикорий (Dorema aucheri), принадлежащий к семейству сложноцветных. По своему вкусу он напоминает кофе, но при этом не содержит кофеина.

Как любые сельскохозяйственные продукты растительного происхождения, кофе и цикорий могут быть контаминированы большим количеством плесневых грибов – микромицетов, включая их ток-сигенные виды. Заражение кофе может происходить на всех этапах его производства, до и после сбора урожая. Кофейное дерево, являясь теплолюбивым растением, приживается только в тропическом и субтропическом климате. Для растительной продук-

Седова Ирина Борисовна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания (e-mail: ; тел.: 8 (495) 698-53-65; ORCID: .

Киселева Мария Геннадьевна – кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания (e-mail: ; тел.: 8 (495) 698-53-65; ORCID: .

Чалый Захар Андреевич – младший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания (e-mail: ; тел.: 8 (495) 698-53-65; ORCID: .

ции стран с жарким и влажным климатом наиболее характерна контаминация микромицетами родов Aspergillus и Penicillium – продуцентами наиболее опасных микотоксинов (МТ) – афлатоксинов (АФЛ) и охратоксина А (ОТА) [5, 6]. Известно, что ОТА на плантациях кофе в тропических и субтропических регионах продуцируют преимущественно аспергил-лы видов A. carbonarius , A. niger , A. ochraceus и A. westerdijkiae , а в регионах с умеренным климатом – Penicillium verruculosum , P. brevicompactum , P. crus-tosum , P. olsonii и P.oxalicum [7, 8]. Способность штаммов, продуцирующих ОТА, загрязнять кофейные зерна зависит от нескольких факторов, таких как климатические условия, условия хранения и транспортировки, а также способы обработки кофе (влажный или сухой) [9]. К естественным загрязнителям кофе также относят грибы рода Fusarium [5] .

Наибольшее количество сообщений, связанных с контаминацией зерна кофе МТ, посвящено его загрязнению ОТА. Имеются сведения о выявлении этого токсина в кофе из Бразилии, Вьетнама, Гватемалы, Индонезии, Китая, Кот-д'Ивуара [10], Южной Кореи, Малайзии, Тайваня, Филиппин и Эфиопии [11–15]. Метаанализ, выполненный Khanakhan et al., позволил подтвердить информацию о повсеместном распространении ОТА в кофе и кофейных напитках разных стран: самая низкая частота обнаружения этого токсина была в кофе из Южной Кореи (3 %), Вьетнама (10 %) и Панамы (19 %); напротив, все образцы из Кувейта и Чили были загрязнены [13]. ОТА обнаруживали не только в зеленом кофе [10, 14, 16], но и в продуктах его переработки [8, 11, 12, 17–19]. Реже сообщают о загрязнении кофе АФЛ и стеригматоцистином (СТЦ) [5, 10, 20, 21]. Garcia-Moralez et al. выявили 100%-ную частоту обнаружения АФЛ В1 в натуральном кофе на уровне от 0,25 до 2,33 мкг/кг [22], а по сведениям Bessire et al. в 18 % проб зеленого кофе выявляли от 0,1 до 1,2 мкг/кг АФЛ В1 [10].

Разработка и внедрение прецизионных аналитических методов мультидетекции позволили проводить комплексную оценку контаминации кофе и кофейных напитков большим числом МТ, а также эмерджентных МТ (ЭМТ). В кофе-бобах были обнаружены фумонизины В2 и В4 [23], в других видах кофе и напитков – энниатины (ЭНН) В, В1, А1, аль-тернариотоксин (метиловый эфир альтернариола, АМЭ), боверицин (БО), цитринин (ЦИТ) и патулин, фумонизин В1 (ФВ1), трихотеценовые МТ и микофеноловая кислота (МФК) [8, 10, 17–19, 24]. Установлено, что обжарка кофе может снижать содержание ОТА на 97 % в зависимости от температуры и размера частиц [25].

В нескольких странах для кофе установлены гигиенические регламенты содержания МТ: в РФ максимальный допустимый уровень (МДУ) АФЛ В1 составляет 0,005 мг/кг1; в странах Евросоюза МДУ ОТА в обжаренном кофе в зернах и молотом кофе – 5 мкг/кг, в растворимом (инстантном) кофе – 10 мкг/кг [26]. В Италии, Финляндии и Греции также регламентируется содержание ОТА в зеленом кофе на уровнях 8, 10 и 20 мкг/кг соответственно [5].

Вопрос о загрязнении цикория МТ в мире до настоящего времени не изучен. В Российской Федерации практически отсутствует информация о загрязнении МТ потребляемых в стране кофе и цикория.

Цель настоящего исследования – изучение частоты и уровней контаминации различных видов кофе, включая зеленый и черный (молотый и зерновой), его заменителя – цикория широким спектром токсических метаболитов: МТ, регламентируемыми в пищевых продуктах растительного происхождения (АФЛ B1, B2, G1, G2; OTA, ДОН, ФB1, ФB2, T-2, ЗЕН), их производными и структурными аналогами (ДАС, HT-2, Т-2 триол, НЕОС – производные Т-2 токсина; 3- и 15-ацДОН, ФУЗ X – производные ДОН), циклопиазоновой кислотой (ЦПК), цитреови-ридином (ЦТВ), ЦИТ, а также ЭМТ (СТЦ, МФК, ЭНН А и ЭНН В, БО, тентоксином (ТЕН), токсинами Alternaria sp. – альтернариолом (АОН), АМЭ и альтенуеном (АЛТ)). Всего перечень исследованных микотоксинов включал 29 видов МТ и ЭМТ.

Материалы и методы. Образцы кофе и цикория были отобраны в торговой сети Москвы и Московской области. Проанализировано 20 образцов зеленого кофе в зернах (сортов арабика и робуста из Центральной и Южной Америки, Африки, Индии и Индокитая) и 12 образцов жареного кофе: в зернах (7 проб сорта арабика) и молотого (5 проб). Цикорий был представлен 15 образцами растворимого напитка (13 порошкообразных, 2 жидких) и одной пробой цикория жареного в кусочках.

Перед экстракцией навески тщательно перемешанных образцов кофе в зернах и жареного цикория массой 50 г размалывали на мельнице до однородного порошкообразного состояния. Образцы молотого кофе тщательно перемешивали, дополнительно не размалывали. Подготовку пробы проводили в соответствии с модифицированной методикой, предложенной для определения МТ в зеленом кофе Bessaire et al. [10]. В центрифужную пробирку вместимостью 50 мл отбирали 1,0 г порошка, добавляли 10 мл дистиллированной воды, перемешивали и оставляли на 10 мин для набухания. Приливали 10 мл ацетонитрила, подкисленного уксусной кислотой (1 % об.), перемешивали и помещали в ульт- развуковую ванну на 10 мин, затем встряхивали в шейкере в течение 10 мин. Затем в пробирку добавляли 1 г хлорида натрия и 4 г безводного сульфата магния, центрифугировали при 4500 об./мин в течение 15 мин. В центрифужную пробирку вместимостью 15 мл вносили аликвоту объемом 5 мл, добавляли 3 мл гексана для обезжиривания, перемешивали в шейкере 10 мин. Далее в пробирку вносили 0,7 г безводного MgSO4. Ацетонитрильную фракцию объемом 3 мл отдували в токе азота и перерастворя-ли последовательным добавлением 100 мкл метанола и 400 мкл воды milliQ. Полученный раствор центрифугировали, супернатант переносили в хроматографическую виалу для анализа.

Для подготовки проб растворимого цикория образцы тщательно перемешивали и отбирали навеску массой 1,0 г в центрифужную пробирку вместимостью 50 мл, добавляли 10 мл дистиллированной воды, перемешивали и приливали 10 мл ацетонитрила, подкисленного уксусной кислотой (1 % об.), вновь перемешивали и помещали в ультразвуковую ванну на 10 мин, затем встряхивали в шейкере в течение 10 мин. Затем в пробирку добавляли 2 г хлорида натрия, центрифугировали при 4500 об./мин в течение 15 мин. Отбирали 800 мкл экстракта в микроцентри-фужную пробирку типа «эппендорф» и добавляли 800 мкл воды milliQ, перемешивали, вновь центрифугировали и переливали супернатант в хроматографические виалы для анализа. Пробы готовили для анализа в двух повторностях.

Анализ проводили с использованием ВЭЖХ системы Vanquish UHPLC, соединенной с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором с подогреваемым источником (TSQ Endura), контролируемым программным обеспечением Xcalibur 4.0 QF2 Software (Thermo Scientific, USA). Разделение аналитов осуществляли на колонке, заполненной силикагелем с привитыми группами октадецилсилана (Titan C18, 2,1×100 мм, 1,9 мкм, Supelco). Температура колонки – 25 °C. Скорость потока элюента – 0,4 мл/мин. Объем вносимой пробы – 10 мкл.

Подвижные фазы для проведения анализа в положительной полярности ионизации: фаза А – вода – метанол (90–10, % об.); Б – метанол – вода – ацетонитрил (10–10–80, % об.), обе фазы модифицированы муравьиной кислотой (0,1, % об.) и 1 мМ формиата аммония. Состав растворителей в подвижных фазах для проведения анализа в отрицательной полярности ионизации был тот же, обе фазы модифицированы 1 мМ формиата аммония, рН фазы А доведен до 9,0 добавлением водного раствора аммиака, тот же объем водного аммиака добавляли в фазу Б. Схема градиента: старт – 0 % Б, 20-я мин – 100 % Б, 20–23,5 мин – 100 % Б, 23,5–24 мин – 0 % Б, с 24-й по 26-ю мин – уравновешивание системы при 0 % Б.

МС/МС детектирование осуществляли в режиме электрораспылительной ионизации в положительной или отрицательной полярности (табл. 1 и 2).

Параметры источника: температура испарителя – 225 °C, напряжение скиммера – 4500 В, температура транспортной трубки – 200 °C, газ завесы – 35, направляющий газ – 10, сметающий газ – 2 единицы (все азот); давление газа для соударений (аргон) – 2 мТорр; минимальное время измерения перехода (dwell time) – 100 мс, разрешение на первом и третьем квадруполях 0,7 и 1,4 FWHM соответственно.

Стандартные растворы 29 МТ готовили из сухих стандартов (Sigma-Aldrich; Fermentek, Jerusalem, Israel). Стандартные растворы хранения готовили в ацетонитриле (АФЛ, СТЦ, ЦИТ, трихотецены групп A и B, ЗЕН и аналоги, OTA), метаноле (токсины Alternaria , ЭНН А, ЭНН В, БО, МФК) или смеси «ацетонитрил / вода» – 50 / 50 (% об.) – ФB1, ФB2 с концентрацией 100 или 500 мкг/мл. Из стандартных растворов готовили мультистандарт и калибровочные растворы. Все растворы хранились при температуре –18 °C.

Для количественного определения МТ использовали внешние градуировки на «чистой» матрице. «Положительные» образцы были разделены на две подгруппы: к первой были отнесены те, в которых был выявлен МТ в количествах, превышающих предел обнаружения метода (ПО), ко второй – содержание МТ в которых превысило минимальную определяемую концентрацию метода (МОК). ПО и МОК, рассчитанные по 3-σ и 10-σ критериям, составили соответственно: 17 и 52 мкг/кг для токсинов ДОН и 3- и 15-ацДОН; 8,7 и 26 мкг/кг для ФУЗ Х; 5 и 17 мкг/кг для МФК; 4 и 12 мкг/кг для Т-2 триола; 2,8 и 8,5 мкг/кг для ЦТВ и ЦПК; 2,3 и 6,8 мкг/кг для АЛТ, АОН, АМЭ и токсина НТ-2; 1,1 и 3,4 мкг/кг для ФВ1, АФЛ G2, ЗЕН и ДАС; 0,7 и 2,0 мкг/кг для ЭНН А; 0,5 и 1,7 мкг/кг для НЕОС, ЦИТ, ТЕН, ЭНН В, БО и Т-2; 0,2 и 0,7 мкг/кг для ОТА и ФВ2; 0,09 и 0,3 мкг/кг для АФЛ G1 и B2; 0,05 и 0,15 мкг/кг для СТЦ и АФЛ В1. Степени извлечения МТ варьировали от 60 до 108 %.

Результаты и их обсуждение. Загрязненность кофе микотоксинами. Изучены частота обнаружения и уровни загрязнения МТ 32 проб зеленого и жареного кофе . Из 29 детектируемых МТ в пробах выявляли шесть видов: МФК, ОТА, БО, АФЛ В1, АФЛ В2 и СТЦ. В 6 % образцов зеленого кофе были обнаружены регламентируемые АФЛ в количествах, не превышающих 5 мкг/кг (0,37 и 1,07 мкг/кг). Наиболее часто, в 44 % случаев, в кофе обнаруживали МФК, реже – БО (в 3 %) и МТ «грибов хранения»: ОТА (6 %), АФЛ В2 (6 %), АФЛ В1 (3 %), а также в следовых количествах СТЦ (табл. 3).

Содержание МФК варьировалось в широком диапазоне от 23,5 до 712,2 мкг/кг. Все исследованные пробы соответствовали требованиям по содержанию АФЛ В1 в кофе, установленным в ТР ТС 021/20111.

Более детальное изучение загрязненности кофе МТ в зависимости от способа его термической обработки представлено в табл. 4.

Таблица 1

Переходы МТ, детектируемых в положительной полярности в режиме мониторинга множественных реакций (MRM)

П р и м е ч а н и е : * первым указан ион, использованный для количественного определения.

МТ	t R, мин	Аддукт	Материнский ион, m/z	Дочерние ионы*, m/z	Энергия соудар., В	Фрагментор, В
ДОН	11,2	[M+H]+	297,1	249,1; 267,1	10,6; 17,9	100
Т-2 триол	11,3	[M+NH 4 ]+	400,2	365,2; 145,2	10; 25	76
ФУЗ Х	11,4	[M+H]+	355,4	247,0; 229,1	12,3; 16,0	103
НЕОС	11,4	[M+NH 4 ]+	400,2	215,1; 197,2	16,6; 16,7	79
HT-2	12,3	[M+NH 4 ]+	442,3	215,1; 263,1	10; 10	91
3- и 15- ацДОН	13,5	[M+H]+	339,1	137,1; 231,1	10; 12,9	97
АФЛ G2	14,1	[M+H]+	331,1	245,1; 189,1; 285,1	30; 41; 27	170
АФЛ G1	14,3	[M+H]+	329,1	243; 200	26; 41	150
ФВ1	14,4	[M+H]+	722,5	704,5; 352,4	28; 36	217
АФЛ B2	14,8	[M+H]+	315,1	287,1; 259,0	32; 29	170
ДАС	14,9	[M+NH 4 ]+	384,2	307,2; 247,1	10,3; 14	89
АФЛ B1	16,1	[M+H]+	313,1	241,0; 213,0	37; 45	166
ТЕН	16,2	[M+H]+	415,3	312,2; 256,2	19; 29	129
ФВ2	16,9	[M+H]+	706,5	336,4; 354,4	36; 34	150
МФК	17,5	[M+H]+	321,0	207,0; 303,1	22; 10	113
T-2	18,9	[M+NH 4 ]+	484,3	215,1; 185,1; 305,2	17; 21; 13	138
ЦТВ	19,1	[M+H]+	403,2	297; 315	10; 10	45
OTA	19,3	[M+H]+	404,1	239; 221	24; 35	123
СТЦ	21,1	[M+H]+	325,1	281,0; 253,0	36; 44	152
ЦПК	21,8	[M+H]+	337,1	182,0; 196,1	19; 23	165
ЭНН B	24,6	[M+NH 4 ]+	657,6	214,2; 527,4	31; 27	142
БО	25,2	[M+NH 4 ]+	801,4	244,2; 134,2	32; 54	215
ЭНН A	25,5	[M+H]+	682,7	210,2; 228,2	24; 24	255

Таблица 2

Переходы МТ, детектируемых в режиме MRM, в отрицательной полярности

МТ	t R, мин	Аддукт	Материнский ион, m/z	Дочерние ионы*, m/z	Энергия соудар., В	Фрагментор, В
ЦИТ_1	12,0	[M+CH 3 OH-H]–	281	249	10	50
ЦИТ_2	12,0	[M-H]–	249,2	115,2; 205,1	52; 18	200
АЛТ	14,2	[M-H]–	291,2	189,2; 203	32; 32	188
АОН	16,2	[M-H]–	256,9	213; 215; 212,1	22; 25; 32	195
ЗЕН	20,0	[M-H]–	317,2	175; 73,1; 131,1	23; 18; 28	228
АМЭ	20,1	[M-H]–	271,1	256; 228; 227,1	21; 29; 37	194

П р и м е ч а н и е : * первым указан ион, использованный для количественного определения.

Таблица 3

Частота обнаружения выявленных МТ в образцах кофе и цикория

МТ	Доля загрязненных МТ проб (> ПО), %		Содержание токсинов в загрязненных пробах, мкг/кг	Доля загрязненных проб (> МОК), %	Содержание МТ в загрязненных пробах, мкг/кг
	< МОК 1	> МОК
		Кофе, n	= 32	Цикорий, n = 16
АФЛ В1	3	-	0,05	6	5,76
АФЛ В2	6	-	0,09; 0,11	-	-
OTA	3	3	0,37; 1,07	6	1,6
СТЦ	3	-		-	-
МФК	-	44	23,5 - 712,2	-	-
ФВ2	6	3	0,2-2,6	-	-
ЭНН В	-	-	-	38	2,8–1109,0
БО	3	-	0,50	56	2,4–1173,0

П р и м е ч а н и е : * ПО – предел обнаружения, МОК – минимальная определяемая концентрация.

Таблица 4

Частота обнаружения и уровни загрязнения МТ зеленого и черного кофе

Токсин	Количество проб		Содержание МТ в загрязненных пробах, мкг/кг		Содержание МТ в пробах всего ряда, мкг/кг
	исследовано	контаминировано, абс. (%)	диапазон	среднее	М	Ме	90 % ур.
Зеленый кофе
МФК	20	11 (55)	23,5–58,3	36,6	20,1	24,1	51,3
АФЛ В2		2 (10)	0,09; 0,11	0,10	0,010	0	0,05
ОТА		1 (5)	1,07	1,07	0,05	0	0
АФЛ В1		1 (5)	0,05	0,05	0,003	0	0
ФВ2		1 (5)	2,60	2,60	0,13	0	0
Черный кофе в зернах
МФК	7	2 (25,6)	155,7; 712,2	434,0	124,0	0	155,7
ОТА		1 (14,3)	0,37	0,1	0,01	0	0,05
Черный молотый кофе
МФК	5	1 (20,0)	72,8	72,8	14,6	0	36,4
БО		1 (20,0)	0,46	0,46	0,09	0	0,23

Таблица 5

Загрязненность цикория микотоксинами

Токсин Количество проб Диапазон загрязнения, мкг/кг Среднее содержание в загрязненных пробах, мкг/кг Содержание МТ в пробах всего ряда, мкг/кг исследовано контаминировано, абс. (%) М Ме 90 % ур. БО 16 9 (56) 2,4–1176,2 152,8 85,9 2,5 84,5 ЭНН В 6 (38) 2,8–1109,0 390,5 156,2 0 604,8 АФЛ В1 1 (6) 5,76 5,76 0,64 0 0 ОТА 1 (6) 1,6 1,6 0,1 0 0 пробах цикория был обнаружен ЭНН В в количестве от 2,8 до 1109,0 мкг/кг, его среднее содержание в загрязненных пробах достигало 390,5 мкг/кг, во всех изученных пробах – 156,2 мкг/кг, в 90 % – 604,8 мкг/кг. Обращает на себя внимание выявление в единичных случаях ОТА (на уровне 1,6 мкг/кг) и АФЛ В1 (5,76 мкг/кг), что превышает гигиенические регламенты содержания АФЛ В1, установленные для некоторых видов продуктов растительного происхождения в РФ (чай, кофе, какао-продукты, зерно и продукты его переработки).

Пробы жидких экстрактов цикория также были контаминированы ЭМТ: один образец содержал 2,8 мкг/кг ЭНН В и 3,6 мкг/кг БО, второй – 1060,2 мкг/кг ЭНН В и 1172,6 мкг/кг БО. Следует отметить, что в жареном цикории был выявлен регламентируемый в пищевых продуктах растительного происхождения АФЛ В1 (в количестве 5,76 мкг/кг) совместно с БО (3,0 мкг/кг).

Выводы:

• 1.    Разработана методика количественного определения микотоксинов методом ультравысокоэф-фективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием: подобраны условия хроматографического и масс-спектрометрического определения для 29 МТ; установлены пределы детектирования и количественного определения и степени извлечения токсинов.

• 2.    Впервые в РФ проведены исследования различных видов кофе и цикория на наличие расширенного спектра из 29 микотоксинов (МТ и ЭМТ), их производных и структурных аналогов. Получены данные, свидетельствующие о широкой распространенности в этих видах продукции малоизученных видов МТ: частота обнаружения ЭМТ,

• 3.    Из числа регламентируемых в пищевой продукции МТ в образцах кофе были обнаружены ОТА, АФЛ и ФВ2, в цикории – АФЛ В1 и ОТА. Обнаружение в растительных продуктах токсинов АФЛ, ОТА и фумонизинов, обладающих канцерогенными свойствами, является фактором потенциального риска здоровью человека при их поступлении с пищей.

• 4.    Полученные в экспериментальных условиях данные о контаминации МТ и ЭМТ кофе и цикория свидетельствуют о необходимости углубленной гигиенической оценки поступающей на российский рынок растительной продукции, особенно из географических регионов с тропическим и субтропическим климатом, условия окружающей среды в которых благоприятны для вегетирования токсигенных плесневых грибов Aspergillus, Penicillium, Fusarium, а также других малоизученных продуцентов микотоксинов и эмерджентных микотоксинов.

представленных МФК и БО, в зеленом и жареном кофе составила 47 % от общего числа исследованных проб, в цикории БО и ЭНН В обнаружены в 94 % проб. Уровни загрязнения МФК кофе достигали 712,2 мкг/кг; максимальное содержание в цикории ЭНН В и БО составило 1109 и 1173 мкг/кг соответственно.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 18-16-00077-П) «Эмерджентные микотоксины в пищевых продуктах растительного происхождения: разработка методов анализа, изучение контаминации, видовая характеристика микромицетов-продуцентов, разработка гигиенических нормативов».