Микотоксины в квасе: характеристика профиля загрязнения традиционного зернового напитка брожения

Микотоксины представляют собой токсичные вторичные метаболиты микроскопических грибов, способные загрязнять продовольственное сырье, включая зерновые культуры, как в период вегетации, так и на этапах его хранения и переработки. Наибольшее значение для продовольственной безопасности имеют токсины грибов родов Fusarium,

Alternaria, Aspergillus и Penicillium, многие из которых обладают гепатотоксическими, нефротоксическими, иммунотоксическими и канцерогенными свойствами1 [1]. В последние годы особое внимание уделяется не только регламентируемым микотоксинам, таким как дезоксиниваленол (DON), токсин Т-2 (T-2), охратоксин А (OTA) и афлатоксины (AFL), но и так называемым эмерджентным микотоксинам, включая энниатины (ENN A и ENN B), боверицин (BEA), тенуазоновую кислоту (TeA), тентоксин (TEN), альтернариол (AOH) и микофеноловую кислоту (MPA), для которых нормативное регулирование отсутствует [2, 3].

Зерновые культуры и продукты их переработки являются одним из основных путей поступления микотоксинов в рацион человека. В связи с этим значительное количество исследований посвящено оценке загрязненности зерна, солода и напитков брожения, производимых на основе зернового сырья. Показано, что отдельные микотоксины способны сохраняться на различных стадиях технологической переработки и переходить в готовую продукцию [4, 5]. Наиболее подробно данные процессы изучены для пива, в котором регулярно выявляются DON, OTA, Т-2 и токсин НТ-2, а также ряд эмерд-жентных микотоксинов, включая ENN B и TeA [5, 6]. Показано, что зерновое сырье и продукты его переработки нередко содержат несколько микотоксинов одновременно, что может приводить к аддитивным или синергическим токсическим эффектам и требует применения мультимикотоксиновых аналитических подходов [7, 8].

Квас является традиционным напитком брожения, широко распространенным в Российской Федерации и странах Восточной Европы. Его производство основано на использовании солода, зернового и хлебного сырья, а также концентратов квасного сусла. По данным Центра отраслевой экспертизы Россельхозбанка, среднедушевое потребление кваса в России увеличилось с 3,6 л на человека в 2017 г. до 5,6 л в 2022 г.2 Благодаря использованию сырья зернового происхождения квас потенциально подвержен контаминации теми же группами микотоксинов, что и другие продукты переработки злаков.

Несмотря на широкое распространение кваса, сведения о его загрязненности микотоксинами в доступной научной литературе отсутствуют. В отличие от зерна, солода и пива, для которых накоплен значительный объем данных о распространенности как регламентируемых, так и эмерджентных микотоксинов, исследования кваса фактически не проводились. Вследствие этого данные об уровнях их содержания и особенностях контаминации данного напитка остаются крайне ограниченными, что затрудняет оценку роли кваса в формировании ми-котоксиновой нагрузки населения.

Цель исследования – определение содержания регламентируемых, модифицированных и эмерджент-ных микотоксинов в образцах кваса, представленных на российском рынке, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.

Материалы и методы. В исследование были включены 34 образца кваса промышленного производства различных производителей и торговых марок, приобретенные в предприятиях розничной торговли Москвы и Московской области.

Определение микотоксинов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС). В анализ были включены 32 микотоксина, относящиеся к различным группам контаминантов зернового сырья: AFL B1, AFL B2, AFL G1, AFL G2, OTA и охратоксин В (OTB); трихо-теценовые микотоксины групп А и В (DON и его производные (ацетильные производные – 3- и 15-ацетилдезоксиниваленол (3-acDON, 15-acDON), фузаренон Х (FUS X) и DON-3-g), T-2, HT-2, диаце-токсискирпенол (DAS), неосоланиол (NEOS), Т-2 триол (T-2 triol)); фумонизины В1 и В2 (FB1 и FB2); зеараленон (ZEN); цитринин (CIT); цитреовиридин (CTV); циклопиазоновая кислота (CPA); MPA; сте-ригматоцистин (STC); ENN A, ENN B, боверицин (BEA), а также альтернариатоксины: TeA, TEN, аль-тернариол (AOH), альтернариол монометиловый эфир (AME) и альтенуен (ALT). Таким образом, исследование охватывало регламентируемые, модифицированные и эмерджентные микотоксины.

Перед анализом образцы дегазировали в ультразвуковой бане. Для экстракции микотоксинов использовали ацетонитрил, подкисленный муравьиной кислотой (99: 1, % об.), и этилацетат. Подготовка проб включала стадии экстракции, высаливания, концентрирования и последующего разбавления экстракта перед инструментальным анализом методом ВЭЖХ-МС/МС в условиях положительной и отрицательной ионизации на хромато-масс-спектрометре Waters Xevo TQ-XC.

Разделение аналитов проводили на колонке Waters ACQUITY UPLC HSS C18, 100 × 2,1 мм, 1,8 мкм. В качестве подвижных фаз использовали смеси «вода – метанол» (90:10, % об.) и «ацетонитрил – метанол» (70:30, % об.), содержащие 0,1 % муравьиной кислоты. Условия градиентного разделения оптимизировали с использованием индивидуальных стандартных растворов микотоксинов. Количественное определение микотоксинов проводили с использованием матричнокалиброванных стандартных растворов. Для количественного определения микотоксинов использовали внешние градуировки на «чистой» матрице. «Положительные» образцы были разделены на две подгруппы: к первой были отнесены те, в которых был выявлен токсин в количествах, превышающих предел обнаружения метода (ПО), ко второй – содержание микотоксинов в которых превысило предел количественного определения метода (ПКО). ПО и ПКО, рассчитанные по 3-σ и 10-σ критериям, составили (соответст-

Таблица 1

Частота обнаружения и уровни микотоксинов в образцах кваса ( n = 34)

Микотоксин	Доля загрязненных проб (> ПО)		Содержание микотоксинов, мкг/л		Среднее по всей выборке, мкг/л
	> ПКО	следовые уровни (< ПКО)	диапазон	среднее
TeA	35 %	–	29,70-75,30	53,40	18,90
TEN	27 %	9 %	< ПКО - 0,60	0,25	0,07
DON	21 %	12 %	< ПКО - 26,20	23,1	4,75
ENN B	21 %	–	0,33-96,00	24,0	4,94
MPA	6 %	–	1,38-1,40	1,39	0,08
HT-2	3 %	–	17,80	17,8	0,52
T-2	3 %	–	4,08	4,08	0,12
OTB	3 %	–	0,51	0,51	0,01
OTA	–	6 %	< ПКО	< ПКО	< ПО
AFL B2	–	3 %	< ПКО	< ПКО	< ПО

Примечание: ПКО – предел количественного определения, ПО – предел обнаружения.

вено мкг/л): 0,03 и 0,10 для токсинов TEN, OTA, STC, ENN A и ENN B; 0,07 и 0,20 для OTB; 0,15 и 0,50 для AFL B1, AFL B2, AFL G1 и MPA; 0,33 и 1,0 для AFL G2 и BEA; 0,6 и 2,0 для AOH, AME и CIT; 1,3 и 4,0 для Т-2 и СРА; 1,7 и 5,0 для FB2 и DAS; 2,0 и 6,0 для FB1; 3,0 и 10,0 для НТ-2, NEOS, CTV, DON-3-g; 3,6 и 12,0 для ALT; 5,0 и 15,0 для DON; 6,0 и 20,0 для 3-acDON, 15-acDON, FUS X и ТеА; 7,5 и 25,0 для ZEN; 2,1 и 70 для Т-2 triol. Степени извлечения микотоксинов варьировали от 64 % (для CTV) до 106 % (для Т-2).

Результаты и их обсуждение. Результаты определения микотоксинов в исследованных образцах кваса представлены в табл. 1.

В образцах кваса были выявлены 10 из 32 исследованных микотоксинов. Наиболее распространенными загрязнителями являлись альтернариаток-сины: TeA и TEN, найденные чуть больше, чем в трети исследованных образцов в количестве до 75,3 и 0,6 мкг/л соответственно. Среднее содержание этих токсинов в загрязненных образцах составляло 53,40 и 0,25 мкг/л соответственно.

Среди фузариотоксинов наиболее часто, в трети образцов, выявляли DON в количестве до 26,2 мкг/л и ENN B – в 21 % случаев в количестве до 96,0 мкг/л. Среднее содержание этих токсинов в загрязненных образцах составило 23,1 и 24,0 мкг/л соответственно. Кроме того, в единичных образцах были обнаружены токсины HT-2 и T-2 в концентрациях 17,80 и 4,08 мкг/л соответственно. Модифицированная форма дезоксиниваленола DON-3-g в исследованных образцах кваса не обнаружена.

Помимо токсинов грибов родов Fusarium и Alternaria , в отдельных образцах были выявлены микотоксины, ассоциированные с грибами хранения. MPA была обнаружена в двух образцах кваса в количестве до 1,4 мкг/л, один образец был контаминирован OTB в количестве 0,51 мкг/л. Кроме того, в нескольких образцах были выявлены OTA и AFL B2 в следовых количествах.

Полученные результаты свидетельствуют о смешанном характере контаминации кваса и указывают на то, что наибольший вклад в формирование микотоксинового профиля напитка вносят грибы родов Alternaria и Fusarium.

Следует отметить, что одновременное присутствие нескольких микотоксинов в квасе было найдено в половине изученных образцов (рисунок). В одной пробе было обнаружено четыре токсина: TEN + ENN B + T-2 + HT-2 (табл. 2). В восьми пробах было выявлено по три токсина (трижды TeA + TEN + DON, дважды TeA + ENN B + DON и однократно ENN B + MPA + TEN, TEN + DON + OTA, ENN B + AFL B2 + OTA). Совместное загрязнение двумя токсинами было найдено в 8 пробах: по 2 пробы содержали TeA + DON и TEN + DON, в единичных пробах были найдены TeA + ENN B, TeA + TEN, ENN B + DON и TEN + MPA.

Полученные результаты свидетельствуют, что квас как продукт брожения зерна может служить источником поступления широкого спектра микотоксинов. Из 32 исследованных соединений в образцах кваса были выявлены 10 микотоксинов. Отличительной особенностью исследованных образцов стало доминирование альтернариатоксинов, прежде всего TeA и TEN, тогда как в большинстве опубликованных работ по напиткам брожения основное внимание уделяется фузариотоксинам, прежде всего трихотеценам, а также охратоксинам [5, 6]. Это позволяет предположить, что микотоксиновый профиль кваса может существенно отличаться от ранее описанного для пива и других ферментированных напитков на основе зернового сырья.

Рис. Частота совместного обнаружения микотоксинов в образцах кваса

Таблица 2

Одновременное обнаружение нескольких микотоксинов в образцах кваса

n конт / n	Выявляемые одновременно микотоксины	Уровни загрязнения, мкг/л
3/34	TeA + TEN + DON	TeA (52,3–67,3); TEN (0,13–0,16); DON ( < ПКО – 24,0)
2/34	TeA + ENN B + DON	TeA (51,0; 52,7); ENN B (0,4; 2,5); DON ( < ПКО – 22,6)
2/34	TeA + DON	TeA (29,7; 53,5); DON (18,7; 23,5)
2/34	TEN + DON	TEN (0,15; 46,4); DON ( < ПКО – 26,0)
1/34	TEN + ENN B + T-2 + HT-2	TEN (0,11) + ENN B (95,99) + T-2 (4,08) + HT-2 (17,76)
1/34	TEN + DON + ОТА	TEN ( < ПКО); DON ( < ПКО); ОТА ( < ПКО)
1/34	ENN B + AFL B2 + OTA	ENN B (65,6); AFL B2 ( < ПКО); OTA ( < ПКО)
1/34	TEN + ENN B + MPA	TEN (0,60); ENN B (0,10); MPA (1,38)
1/34	TeA + TEN	TeA (64,2); TEN ( < ПКО)
1/34	ENN B + DON	ENN B (3,0); DON (26,2)
1/34	TeA + ENN B	TeA (35,0); ENN B (0,33)
1/34	TEN + MPA	TEN (0,41); MPA (1,40)

Примечание: n – количество исследованных образцов; n _конт – количество контаминированных образцов.

Наиболее часто выявляемым микотоксином являлась TeA, обнаруженная в 35 % образцов. TEN было загрязнено 27 % образцов, при этом еще в 9 % образцов токсин присутствовал на уровнях ниже ПКО. Оба соединения относятся к метаболитам грибов рода Alternaria и рассматриваются как характерные загрязнители зернового сырья [9, 10]. Несмотря на растущий интерес к альтернариаток-синам, данные об их присутствии в напитках брожения остаются крайне ограниченными [8, 11]. Вместе с тем в последние годы все большее внимание уделяется изучению встречаемости и совместного присутствия эмерджентных и модифицированных микотоксинов в пищевых продуктах и напитках [12]. Ранее присутствие альтернариаток-синов, включая TeA, было показано в пиве и солодовых напитках [13]. Среди исследованных соединений именно TeA характеризовалась наиболее высокой способностью переходить из зернового сырья в готовый напиток [10, 14]. Полученные результаты указывают, что аналогичные процессы могут происходить и при производстве кваса. Учитывая практически полное отсутствие опубликованных данных по данному напитку, выявление TeA и TEN следует рассматривать как один из наиболее важных результатов настоящего исследования.

Среди фузариатоксинов наибольшее значение имели DON и ENN B. DON обнаруживали в 21 % образцов на уровнях выше ПКО и еще в 12 % образцов в следовых количествах. Данный результат согласуется с многочисленными исследованиями по изучению загрязненности зерна, солода и пива, в которых DON рассматривался как один из наиболее распространенных микотоксинов продукции на основе ячменя, пшеницы и ржи [4, 5, 15]. Известно, что этот токсин обладает высокой устойчивостью к технологической переработке и способен сохраняться на различных стадиях производства напитков брожения, что объясняет его присутствие в готовой продукции [4, 5].

Особого внимания заслуживает ENN B, выявленный в 21 % исследованных образцов кваса. Максимальная концентрация данного соединения достигала 96,0 мкг/л, что являлось одним из наиболее высоких значений среди всех обнаруженных микотоксинов. В последние годы ENN B рассматривается как один из наиболее распространенных эмерджентных микотоксинов зернового происхождения [2]. Его регулярное обнаружение в зерне, солоде, пиве и других продуктах переработки злаков описано в [2, 16]. Учитывая отсутствие опубликованных данных о загрязненности кваса микотоксинами, полученные результаты впервые продемонстрировали возможность присутствия ENN B в данном напитке. Полученные результаты указывают на необходимость дальнейшего изучения его распространенности.

Следует отметить отсутствие в исследованных образцах кваса DON-3-g. Ранее было показано, что модифицированные формы DON могут присутствовать в зерновом сырье, солоде и пиве наряду со свободным DON [4, 17]. В отдельных исследованиях содержание DON-3-g было сопоставимо с концентрациями исходного токсина. В настоящей работе данное соединение не обнаружено, что может быть связано как с особенностями используемого сырья, так и с технологическими характеристиками исследованных образцов кваса.

Помимо полевых микотоксинов в отдельных образцах были обнаружены MPA, OTB, а также в следовых количествах OTA и AFL B2, появление которых обычно связывают с поражением сырья и продукции из него грибами родов Penicillium и Aspergillus на стадиях хранения [18]. Несмотря на относительно низкую частоту обнаружения, их присутствие указывает, что формирование микотокси-нового профиля кваса определяется не только заражением зернового сырья в период выращивания, но и условиями его последующего хранения.

Для ориентировочной оценки поступления обнаруженных микотоксинов с квасом проведен сце- нарный расчет пищевой экспозиции. Расчет выполняли по формуле:

EDI =

C-V - 1000

BW

где EDI – расчетная суточная пищевая экспозиция, нг/кг м.т./сут;

C – содержание микотоксина в квасе, мкг/л;

• V – объем потребления кваса, л/сут;

BW – масса тела, кг.

Для расчетов использовали среднее содержание каждого микотоксина во всей выборке и максимальную выявленную концентрацию. Поскольку квас является сезонным напитком, были рассмотрены три условных сценария потребления: 0,25; 0,5 и 1,0 л/сут. Для DON, суммы T-2 и HT-2, а также TeA и TEN расчетную экспозицию сопоставляли с опубликованными токсикологическими ориентирами [19–21]. Результаты расчетов приведены в табл. 3.

При использовании средних концентраций микотоксинов наибольшие значения расчетной экспозиции были получены для TeA, ENN B и DON, а при использовании максимальных концентраций – для ENN B и TeA. Для DON расчетная экспозиция составляла 1,7–6,8 % условно переносимого суточного поступления (УПСП) при использовании средних концентраций и 9,4–37,4 % при использовании максимальной концентрации. Для суммы T-2 и HT-2 расчетная экспозиция при средних концентрациях соответствовала 9,1–36,6 % группового переносимого суточного поступления (ПСП). Для образца с максимальным совместным содержанием T-2 и HT-2

расчетная экспозиция превышала групповой ПСП при всех рассмотренных сценариях потребления. Полученные результаты следует рассматривать как скрининговую оценку, основанную на условных сценариях потребления.

Важной особенностью выявленной контаминации является одновременное присутствие в квасе соединений различного происхождения, ассоциированных с грибами родов Fusarium, Alternaria, Penicillium и Aspergillus . В последние годы все больше внимания уделяется комбинированному воздействию нескольких токсинов, поскольку даже низкие концентрации отдельных соединений могут проявлять аддитивные или синергические эффекты при совместном поступлении в организм [7]. Хотя оценка совместного воздействия обнаруженных микотоксинов не входила в задачи настоящего исследования, выявленный спектр загрязнителей подтверждает актуальность мультимикотоксинового подхода при оценке безопасности зерновых напитков.

Выводы. В настоящем исследовании впервые проведена оценка загрязненности кваса микотоксинами, включая регламентируемые, модифицированные и эмерджентные формы, методом ВЭЖХ-МС/МС. Из 32 исследованных соединений в образцах кваса были выявлены 10 микотоксинов, относящихся к различным группам грибных контаминан-тов зернового происхождения. Наиболее часто обнаруживались TeA, TEN, DON и ENN B, что свидетельствует о существенном вкладе грибов родов Alternaria и Fusarium в формирование микотоксино-вого профиля данного напитка.

Таблица 3

Сценарная оценка суточной пищевой экспозиции микотоксинов при потреблении кваса

Токсин	Содержание токсина	Концентрация токсина, мкг/л	Расчетная суточная экспозиция, нг/кг м.т./сут			Токсикологический ориентир, нг/кг м.т./сут
			0,25 л кваса	0,5 л кваса	1,0 л кваса
TeA	Среднее	18,90	67,50	135,00	270,00	TTC 1500
	Максимальное	75,30	268,93	537,86	1075,71
TEN	Среднее	0,07	0,25	0,50	1,00	TTC 1500
	Максимальное	0,60	2,14	4,29	8,57
DON	Среднее	4,75	16,96	33,93	67,86	УПСП 1000
	Максимальное	26,20	93,57	187,14	374,29
ENN B	Среднее	4,94	17,64	35,29	70,57	Не установлен
	Максимальное	96,00	342,86	685,71	1371,43
MPA	Среднее	0,08	0,29	0,57	1,14	Не установлен
	Максимальное	1,40	5,00	10,00	20,00
HT-2	Среднее	0,52	1,86	3,71	7,43	ПСП 25
	Максимальное	17,80	63,57	127,14	254,29
T-2	Среднее	0,12	0,43	0,86	1,71
	Максимальное	4,08	14,57	29,14	58,29
OTB	Среднее	0,01	0,04	0,07	0,14	Не установлен
	Максимальное	0,51	1,82	3,64	7,29

Примечание: средние значения содержания соответствуют среднему по всей исследованной выборке ( n = 34), включая образцы, в которых соответствующий микотоксин не был обнаружен. Для расчета по максимальному содержанию использовали наибольшую выявленную концентрацию каждого микотоксина. OTA и AFL B2 не включены в расчет, поскольку были выявлены только на уровнях ниже ПКО. Для T-2 и HT-2 приведен общий токсикологический ориентир, установленный для суммы T-2, HT-2 и диацетоксискирпенола. УПСП – условно переносимое суточное поступление; ПСП – переносимое суточное поступление; TTC – порог токсического воздействия.

Полученные результаты показали, что квас может содержать как регламентируемые, так и эмерджентные микотоксины различного происхождения. При этом наиболее характерной особенностью исследованных образцов являлось доминирование альтернариатоксинов, прежде всего TeA и TEN, тогда как среди фузариатоксинов наибольшее значение имели DON и ENN B. Выявление OTB, OTA и MPA дополнительно указывает на возможный вклад условий хранения сырья в формирование микотоксинового профиля готовой продукции.

Полученные данные восполняют существующий пробел в литературе и подтверждают необходимость включения кваса, концентратов квасного сусла и другого сырья, используемого для его производства, в программы мониторинга микотоксинов. Проведенная сценарная оценка пищевой экспозиции показала, что при средних уровнях загрязнения вклад кваса в поступление DON и T-2 / HT-2 невелик, тогда как при высокой контаминации отдельных образцов возможны уровни экспозиции, требующие дальнейшего изучения. Перспективными направлениями дальнейших исследований являются расширение географии и объема выборок, изучение влияния отдельных технологических стадий на перенос микотоксинов в готовый продукт, а также оценка рисков, связанных с одновременным присутствием нескольких микотоксинов в квасе.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда № 25-16-00207.