Микробиологические аспекты технологии напитков на основе порошкообразных солодовых экстрактов

Разработка пищевых продуктов для обеспечения здорового питания с расширением ассортимента выпускаемых новых продуктов – с повышенной пищевой ценностью, улучшенными и заранее заданными свойствами для снабжения организма необходимыми нутриентами чрезвычайно актуальна.

Напитки – наиболее удобная модель для проектирования продуктов с применением различного натурального сырья, самый технологичный и приемлемый продукт для создания нового вида функционального питания. Расширение ассортимента «полезных» напитков, обладающих набором функциональных свойств, раскрывает возможности управления процессом поступления в организм человека биологически активных веществ.

Важным моментом, отражающим необходимость изменения направленности питания в современных условиях, является снижение поступления в организм пробиотиков в виде молочнокислых бактерий (далее – МКБ), би-фидобактерийи продуктов их метаболизма. Это вызвано, с одной стороны, реализацией повышенных гигиенических требований к выпускаемым продуктам питания, с другой – жесткими рекомендациями логистики товарного обращения[1, 2].

Безалкогольные напитки на основе зернового сырья, предлагаемые производителямина рынке с тривиальным названием «квасы брожения», предполагают участие в технологическом процессе только дрожжевой монокультуры. Необходимая величина кислотности достигается не в результате жизнедеятельности молочнокислых бактерий, а внесением пищевых органических кислот – молочной или лимонной.

Процесс приготовления кваса предусматривает обязательное использование МКБ, часто без реализации технологических стадий фильтрации и пастеризации. Полезный напиток должен быть только «живым» и свежим, хорошо осветленным с помощью седиментации и декантации при низкой температуре с естественным процессом спиртового и гетеро-ферментативного молочнокислого брожения, приготовленным с тщательным соблюдением санитарно-гигиенических требований[3].

Квас относится к группе безалкогольных напитков с ярко выраженными полезными свойствами, он богат витаминами, в том числе группы В. Пищевая ценность этого напитка брожения дополняется присутствием органических кислот и других продуктов жизнедеятельности дрожжей и МКБ.

Совместное существование дрожжей и бактерий оказывает взаимное влияние на жизнедеятельность этих микроорганизмов. Между ними складываются симбиотические взаимоотношения, при которых бактерии продуцируют кислоты до рН 5,0-5,5 полезных для дрожжей, а продукты их автолиза,в частности, аминокислоты, пептиды и витамины, служат питание для бактерий.

Квасное сусло, приготовленное по традиционной технологии из концентрата квасного сусла (далее – ККС), является неполноценной средой для размножения дрожжей и МКБ: для дрожжей снижена доля растворимого азота, а для МКБ завышено количество углеводных компонентов углеводов.

При разработке напитков для приготовления квасного сусла применяли порошкообразные солодовые экстракты на основе свеже-проросших солодов:ППЭ-1 – гречихи, кукурузы, ячменя; ППЭ-2 – гречихи, гороха, ячменя; ПГрСЭ – гречихи; ПГСЭ – гороха, обладающие высокой пищевой и биологической ценностью [4, 5, 6].

Цель аналитического этапа работы – предварительное обобщение данных для изучения целесообразности и возможности применения молочнокислых и бифидобактерий наряду с дрожжами в технологии квасов с последующим исследованием влияния рецептурных компонентов на продолжительность сбраживания квасного сусла и стойкость готовых напитков, в конечном итоге – с разработкой рецептур квасов на основе порошкообразных солодовых экстрактов, обладающих функциональными свойствами.

Основные объекты исследования, предоставленные Российской биотехнологической компанией ЗАО «Партнер»– лиофилизированная биомасса бактерий (субстанции) – очищенные от среды культивирования и лиофиль-но высушенные с сахарозо-желатиновой защитной средой смешанные с лактозой: Lactobacillus plantarum штамма 8Р – А3, Bifidobacterium bifidum штамма №1, Bifidobacterium longum штамма №1-п.

Для сбраживания сусла применяли чистые культуры дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae расы XII (кафедра биохимии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»).

Направления исследований – контроль физико-химических показателей квасного сусла, приготовленного на различном исходном сырье до и после брожения; изучение влияния рецептурных компонентов напитков на продолжительность брожения квасов с обоснованием применения в технологии напитков лакто- и бифидобактерий, определяющих их функциональные свойства; разработка рецептур квасов на основе порошкообразных солодовых экстрактов, обладающих функциональными свойствами; контроль физикохимических, органолептических показателей полученных образцов квасов.

Основные ингредиенты рецептуры кваса согласно классической технологии обозначены в таблице 1 (реализуемые этапы технологии кваса: приготовление и сбраживание квасного сусла;охлаждение и купажирование напитка).

Т а б л и ц а 1

Рецепту	ра на квас хлебный (на 100 дал)
Наименование сырья	Единица измерения	Показатели сырья		На кон-цен-трате квасного сусла (ККС)
		Влажность, %	Содержание сухих веществ, %
Сахар	кг	0,14	99,86	50
Концентрат квасного сусла (ККС)	кг	30	70	29,4
Дрожжи хлебопекарные	кг	8	92	0,2

Для проведения эксперимента готовили 5 образцов квасного сусла по традиционной технологии: на основе ККС – в качестве образца сравнения; на основе ППЭ-1 – образец №1, на основе ППЭ-2– образец №2, на основе ПГрСЭ – образец №3 и на основе ПГСЭ – образец №4.

Квасное сусло готовили с использованием 70 % ККС от расчетного количества. ККС разбавляли водой температурой 30-35 ºС в соотношении 1:2 – 1:2,5. Затем доводили водой до содержания сухих веществ 1,4-1,6 %, вносили сахарный сироп – 25 % от расчетного количества, чтобы не допустить избыточного накопления спирта при брожении с массовой долей (СВ) в сусле не менее 2,5 %. Квасы на основе экстрактов готовили по рецептурам (таблица 2) [4].

Сусло на основе солодового и полисоло-дового экстрактов готовили с использованием порошкообразного экстракта с учетом пересчета на массовую долю (СВ) в сусле. Экстракт разбавляли водой температурой 30-35 оС в со- отношении 1:3 – 1:3,5, затем добавляли воду до содержания сухих веществ 1,4-1,6 %. Вносили сахарный сироп – 25 % от расчетного количества. Содержание сухих веществ в сусле для кваса, приготовленного на основе порошкообразного экстракта составляло не менее 2,5 %.

Т а б л и ц а 2

Рецептура кваса на основе солодовых и полисолодовых экстрактов (на 100 дал)

Наименование сырья	Единица измерения	Показ сы	атели рья	На готовый напиток
		Влажность, %	Содержание сухих веществ, %
Сахар	кг	0,14	99,86	50
ПГрСЭ	кг	3	97	21,22
ППЭ-1	кг	3	97	21,22
ППЭ-2	кг	3	97	21,22
ПГСЭ	кг	3	97	21,22
Дрожжи сухие хлебопекарные	кг	8	92	0,018
Закваска бактерий	кг	10	90	1 уч. ед. лиофилизированной культуры

Сбраживание квасного сусла дрожжами проводили до снижения массовой доли сухих веществ на 1,0 % по сахаромеру и достижения значения кислотности не ниже 1,5 см3 раствора NaOH концентрацией 1 моль/дм3 на 100 см3 кваса. Продолжительность брожения при этих условиях составляла13-18 часов.

Затем квас охлаждали до температуры 67 ºС для седиментации дрожжевых клеток и купажировали.

Квасное сусло для получения кваса готовили таким образом, чтобы во всех образцах массовая доля (СВ) была одинаковой. При использовании ПГрСЭ с массовой долей (СВ), отличающейся от приведенной в рецептуре, проводили соответствующий пересчет расхода экстракта. рН квасного сусла в образце сравнения и в остальных образцах №1, №2, №3, №4 не оптимальны для жизнедеятельности дрожжей, поэтому для подкисления среды применяли лимонную кислоту, рН доводили до значения 4,5-5,0 (таблица 3).

Т а б л и ц а 3

Физико-химические показатели образцов квасного сусла

Наименование показателя	Значение показателя
	Образец сравнения	Образец №1	Образец №2	Образец №3	Образец №4
Массовая доля сухих веществ, % (по ГОСТ 6687.2 – 90)	4	4	4	4	4
Кислотность, к.ед (по ГОСТ 6687.4 – 86)	0,9	0,85	0,87	0,7	0,75
рН (по ГОСТ 6687.4 – 86)	4,65	4,8	4,9	4,6	4,7
Массовая доля редуцирующих сахаров, % (по ТИ-18-6-47-85)	-	2,52	2,54	2,65	2,58

Брожение образцов сусла осуществляли при температуре 30 ºС.

Динамика уменьшения массовой доли (СВ) на 1,0 % по сахаромеру при сбраживании сусла дрожжами приведена на графике (рисунок 1).

Рисунок 1. Динамика изменения сухих веществ в процессе брожения квасного сусла на основе ККС - образец сравнения, ППЭ-1 – образец №1, ППЭ-2 – образец №2, ПГрСЭ – образец №3, ПГСЭ – образец №4.

Более интенсивное снижение массовой доли (СВ) при брожении наблюдали в образцах квасного сусла на основе порошкообразных солодовых экстрактов из ППЭ-1, ПГрСЭ,

ППЭ-2, по сравнению с образцом сравнения продолжительность брожения при этом меньше на 3 ч, 2 ч, 1 ч. соответственно.

Видимо, данное обстоятельство обусловлено более высоким содержанием сбра- живаемых углеводов и мальтозы в исходном сырье в образцах №1, №2 и №3, что стимулирует перестройку обмена веществ дрожжевых клеток с аэробного на анаэробный метаболизм.

Для проведения экспериментальных исследований применяли ампулы с лиофилизированной культурой бактерий, предоставленные ЗАО «Партнер». Лиофилизированная биомасса бактерий (субстанция) представляет собой очищенные от среды культивирования и лиофильно высушенные с сахарозожелатиновой защитной средой клетки бифидобактерий Bifidobacterium bifidum №1, Bifidobacterium longum №1-п и Lactobacillus plantarum 8Р-А3, смешанные с лактозой. Одна ампула предназначена для выработки одной партии продукта, из расчета 1 учетная единица (1 уч. ед.) на 1000 кг нормализованной смеси. Морфологические признаки бактерий представлены в таблице 4.

Подготовку проб квасного суслас целью биологического подкисления в процессе молочнокислого брожения проводили в два этапа: активизация лиофилизата бактерий, сбраживание квасного сусла.

Т а б л и ц а 4

Морфологические признаки исследуемых видов бактерий *

Показатели	Bifidobacterumbifidum № 1	Bifidobacterinlongum 1-n	Lactobacillusplantarum 8P-A3
1	2	3	4
Размер клеток, мкм	2,0-4,5	2,0-4,5	5,5-1,0
Оптимальная температура роста, о С	38±1	37±1	37±1
Отношение к Граму	Г+	Г+	Г+
Отношение к кислороду	Строгий анаэроб	Облигатный анаэроб	Факультативный анаэроб
КОЕ/г в учетной единице	9*10 10	2,9*10 10	10,4*10 10
Образуемые колонии
на твердой среде Блаурокка:	"гвозди", "крошки" белого цвета, полупрозрачные плоские округлые с волнистыми краями	"шарики"	выпуклые, круглые с ровным краем белого цвета

П р о д о л ж е н и е т а б л. 4

1	2	3	4
на жидкой среде	рыхлая масса с прозрачной верхней частью среда
Размер образуемых колоний:
среда Блаурокка, мм	2-3мм	2-3мм, зона аэробиоза 10%	0,5-2,5
жидкая среда, %	зона аэробиноза 10%

* - по Определителю бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. – М.: Мир, 1997. – 432 с. ил.].

Активизацию лиофилизата бактерий проводили на кафедре биохимии и биотехнологии в подготовленном стерильном боксе. В каждую ампулу с культурой вводили по 10 см3физраствора и ставили в термостат при температуре 37 оС на 3 часа для кратковременного активизирования бактерий.

В колбы с подготовленным стерильным квасным суслом вводили активизированные бактерии с соблюдением всех правил микробиологической стерильности.

1 ампула с бактериями содержит 10 см3 суспензии. Данная учетная единица рассчитана на 1000 кг готового продукта, тогда на 1 дм3 готового кваса необходимо внести 0,01 см3 бактериальной суспензии.

Количество бактерий, вносимых в сусло (из расчета на 1 дм³ готового напитка), составляло: Bifidobacterium bifidum № 1: КОЕ/см³ 9*10⁷; Bifidobacterium longum №1-п: КОЕ/см³ 2,9*10⁷; Lactobacillus plantarum 8Р-А3: КОЕ/см³ 10,4*10⁷.После засева колбы с суслом помещали в термостат при 37 ^оС для осуществления процесса молочнокислого брожения в течение 24 ч.

В ходе брожения контролировали изменение кислотности квасного сусла в процессе жизнедеятельности бифидо- и лактобактерий.

Рисунок 2. Динамика изменения кислотности при сбраживании квасного сусла бактериями Bifidobacterium longum №1-п.

Анализ экспериментальных данных позволяет сделать вывод о наиболее интенсив- ном возрастании величины кислотности в процессе жизнедеятельности бактерий L. plantarum и B. longum (максимально – в случае сбраживания сусла на основе ПГСЭ и ППЭ-2). В случае подкисления L. plantarum кислотность сусла (из ПГрСЭ и ППЭ-2) с 0,9 ед.к. возросла до 3,2 ед.к., в случае подкисления B. longum кислотность сусла (из ПГрСЭ и ППЭ-2) с 0,75 ед.к. возросла до 2,5 ед.к, что связано с более высоким содержанием белковых веществ в образцах по сравнению с суслом на основе ККС и превращением присутствующих сахаров в молочную кислоту.

В ходе сбраживания квасного сусла из различных видов солодового экстракта бактериями, массовая доля (СВ) снижается на 0,4-0,5%.

Осуществляли микробиологический контроль дрожжевых клеток перед внесением их в подкисленное бактериями квасное сусло.

Проводили количественную оценку культуры дрожжей с помощью камеры Горяева методом подсчета клеток под микроскопом и исследовали их способность к размножению в квасном сусле на основе порошкообразных солодовых экстрактов в процессе брожения, определяли упитанность клеток по гликогену, контролировали количество нежизнеспособных и почкующихся клеток согласно стандартным методикам (таблица 5).

Т а б л и ц а 5

Микробиологические показатели дрожжей *

Показатели	Saccharomycescerevisia e раса XII
На момент засева
КОЕ/см3	9,12*107
Упитанность по гликогену, %	59,8
Количество почкующихся клеток, %	43,0
Количество мертвых кле ток, %	1,4
На 6-й чассбраживания в подкисленном бактериями сусле
КОЕ/см3	2,3*108
Упитанность по гликогену, %	78,3
Количество почкующихся клеток, %	67,5
Количество мертвых клеток, %	1,1

*- методы исследования по ГОСТ 30712-2001.

Исследовали процесс сбраживания дрожжами подкисленного бактериями квасного сусла.

Для сбраживания квасного сусла, подкисленного после 24 ч культивирования бифидо- и лактобактерий, использовали пробирку с чистой культурой дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII на пивном сусле-агаре.

В пробирку с чистой культурой дрожжей вносили 5 см3 стерильногофизраствора. Энергично встряхивали пробирку и помещали жидкую фракцию в колбу с суслом.

Брожение подкисленного сусла с помощью дрожжей проводили при температуре 30 оС до уменьшения массовой доли (СВ) сусла на 1,0 %.Наблюдали более интенсивное сбраживание подкисленного бактериями сусла по сравнению с образцом без применения бактерий.

При исследовании динамики сбраживания дрожжами подкисленного бактериями квасного сусла более интенсивное снижение массовой доли (СВ) наблюдали в образцах подкисленного бактериями B. bifidum №1 квасного сусла на основе порошкообразных солодовых экстрактов из ПГрСЭ, ППЭ-2, ПГСЭ и ППЭ-1 по сравнению с образцом сравнения, продолжительность брожения составила 12,5 ч, 13,0 ч, 13,5 ч и 14,0 ч соответственно.

Рисунок 3. Динамика сбраживания подкисленных бактериями B. bifidum №1 образцов квасного сусла дрожжами

Исследовали физико-химические показатели образцов готовых квасов в процессе хранения.

По окончании брожения сброженный квас охлаждали до температуры 6-7 ºС для седиментации дрожжевых клеток и осветления кваса. Затем квас декантировали и вносили 75 % сахарного сиропа (от общего количества) и 30 % 1,5 %-го водного раствора порошкообразного солодового экстракта, предусмотренных рецептурой.

В готовом напитке контролировали физико-химические и органолептические показатели. Органолептические показатели полученных образцов кваса соответствовали требованиям ГОСТ Р 53094 – 2008: внешний вид – непрозрачная пенящаяся жидкость, без посторонних включений; вкус – освежающий кислосладкий; аромат – сброженного напитка. По степени насыщения диоксидом углерода в соответствии с ГОСТ 28188 – 89 полученные образцы кваса относились к среднегазированным, о чем свидетельствует наличие высокой и стойкой пены, что оказывает положительное влияние на оценку внешнего вида напитков.

Образцы квасов соответствовали физико-химическим показателям ГОСТ Р 530942008 «Квасы. Общие технические условия».

Контролировали стойкость образцов кваса. Можно сделать вывод о более продолжительной стойкости в случае применения бактерий B. bifidum и дрожжей и по сравнению с L. рlantarum и B.longum 1-п и дрожжевой закваски (максимально - в случае образцов на основе ПГрСЭ и ППЭ-2), о чем свидетельствует небольшое изменение величины кислотности в процессе хранения при температуре 20 ^оС. Период стойкости кваса с указанным видом бактерий составил 7 суток.

Исследовали влияние применения бактерий на некоторые физико-химические показатели образцов.

Из представленных и изученных образцов квасов выбирали те, стойкость которых была увеличена по сравнению с квасом на основе ККС. Выбранная партия содержит три вида кваса на основе ППЭ-1 с применением комбинированной закваски бактерий.

Количественно определяли присутствие бактерий в готовом напитке к концу срока годности. Из исследуемых образцов готовили мазки, окрашивали метиленовым синим и рассматривали под микроскопомс увеличением x1350 .

Интерпретация результатов микробиологического исследования представляла собой информацию о количестве КОЕ/см3 исследуемых бактерий на момент засева, в готовом напитке и по окончании срока годности. Данные представлены в таблице 6.

Количественную оценку культуры бактерий по окончании срока годности проводили методом высева. Метод заключается в проведении серийных разведений и высевом их на питательную твердую среду с последующим культивированием. Для создания анаэробных условий в чашку Петри после застывания среды вкладывали специальный агент.

По истечении продолжительности культивирования на чашке Петри подсчитывали количество выросших колоний и проводили расчет результатов по формуле.Фото препарата с колониями Bifidobacterium bifidum № 1представлены на рисунке 4, результаты расчетов иведены в таблице 6.

Рисунок 4.   Фотография  препарата мазков

Bifidobacterin bifidum № 1.

Т а б л и ц а 6

Количественная оценка культур бактерий

КОЕ/см3	B.bifidum№1	B.longum 1-п	L.рlantarum 8Р-А3
Засеяно в сусло	1,3*105	4,1*105	1,5*105
В готовом напитке	2,9*108	1,1*108	3,1*108
На конец срока годности	3,3*106	1*106	2,3*106