Микробиологические аспекты влияния НЧ Fe на организм крыс Wistar

Нанотехнологии сегодня являются одной из наиболее быстро развивающихся отраслей науки и техники. Во многом это обусловлено уникальными свойствами наночастиц, обладающих в одном из трех измерений размерностью Для цитирования

Короткова А.М., Кван О.В., Вершинина И.А., Лебедев С.В. Микробиологические аспекты влияния НЧ Fe на организм крыс Wistar // Вестник ВГУИТ. 2019. Т. 81. № 3. С. 168–173.

менее 100 нм. Перспективность использования наночастиц и наночастиц (НЧ) объектов связана с отличием их физико-химических и биологических свойств как от свойств объектов в макрофазах, так и свойств отдельных атомов, в частности: низкая токсичность и высокая биодоступность

This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International License

при размерности около 100 нм [1–3]. Данные характеристики -НЧ объективно определили появление новых источников микроэлементов на их основе, целесообразность использования которых в составе рационов для животных и птиц демонстрируется рядом работ [4, 5]. Высокая биодоступность в сравнении с традиционно применяемыми источниками микроэлементов позволяет говорить о возможности создания препаратов – микроэлементов на основе наночастиц. Значительный интерес представляет использование некоторых нутриентов (в особенности минеральных веществ, витаминов и антиоксидантов) в форме НЧ [6, 7], что позволяет не только улучшить усвояемость пищевых веществ в составе обогащенных продуктов и биологически активных добавок к пище, но и в значительном числе случаев избежать эффектов химической или биологической несовместимости нутриентов.

Важным путём поступления металлов из препаратов НЧ является путь через поглощение бактериальными клетками желудочно-кишечного тракта [8, 9]. При этом изменяется состав микрофлоры. Так, дача животным НЧ Cu сопровождается увеличением общего количества бактерий и лактобактерий, и снижением популяции E. coli и Clostridium spp . [10]. При попадании в кишечник часть УДЧ способна формировать пул на внутренней стенке кишечника [11], в связи с чем может взаимодействовать с микроорганизмами, населяющими ЖКТ. Как известно, кишечная микробиота играет жизненно важную роль в питательных и иммунологических функциях животных-хозяев [12].

Однако в литературе пока недостаточно данных о влиянии НЧ на микробиоценоз кишечника различных представителей животного мира и человека.

Цель исследования – изучение влияния наночастиц Fe, введенных per os на представителей основных физиологических групп микроорганизмов.

Материалы и методы

В исследовании были использованы наночастицы Fe, диаметр 100 ± 10 нм получен методом электрического взрыва проводника в атмосфере аргона (ООО «Передовые порошковые технологии», Россия).

Эксперименты выполняли в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики [ГОСТ Р 53434– 2009], а также с инструкциями, рекомендуемыми «The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» [National Academy Press Washington, D.C. 1996]. Уход за животными осуществлялся согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ [ГОСТ 3 51000.4–96].

Соблюдались требования гуманного обращения с животными [13]. В эксперименте применялись стандартные процедуры эксплуатации биообъектов.

Схема исследования. По принципу аналогов были отобраны 30 крыс-самцов линии Wistar в возрасте 4 месяцев, одинаковых по массе (от 180 до 250 г), физиологическому состоянию, находившихся в предшествующий опыту период в условиях сбалансированного питания по рекомендациям [14].

Животные были размещены в аттестационном виварии Института биоэлементологии Оренбургского государственного университета. Виварий укомплектован всем необходимым оборудованием и компетентным персоналом. Ветеринарные требования соблюдены.

В период эксперимента подопытные животные находились в одинаковых условиях содержания.

Дозы для перорального введения были выбраны исходя из литературных данных, что для человека необходимая физиологическая доза составляет от 5 до 20 мг в сутки. Таким образом, нами были выбраны дозы в 5; 10 и 20 мг, затем дозы были пересчитаны на вес крысы.

Препараты НЧ Fe для введения per os готовили в изотоническом физиологическом растворе, обрабатывая в течение 30 мин на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т («НПП Академприбор», Россия) (5 кГц, 300 Вт, 10 мкА). Наночастицы в необходимом количестве смешивали с рисом.

Рационы и корма. Животные всех группы получали полусинтетический рацион, включавший рис полированный вареный 30 г; сахароза 1 г; соевый концентрат 1,25 г; масло растительное рафинированное 1 г. Поение осуществлялось бидистил-лированной водой. Минеральную обеспеченность осуществляли путем добавления смеси жиро- и водорастворимых витаминов.

Микробиологический анализ кала. Бактериологическое исследование кала проводилось путем исследования фекалий при высеве их в разведении 10^-4 в 1 мл на среды МПА, Эндо, желточно-солевой агар, висмут-сульфит агар, бифидоагар и среду Рогоза при соответствующих условиях инкубации (таблица 1). Количественный состав всех видов микроорганизмов в 1 г фекалий определяли по формуле: S = N · Л · В, где S – количество микроорганизмов в 1 г фекалий; N – количество колоний, выросших на чашке; А – коэффициент посевной дозы; В – степень разведения материала [10].

Морфология и биохимия крови. Морфологический состав крови определяли на автоматическом гематологическом анализаторе URIT-2900 Vet Plus («URIT Medical Electronic Group Co., Ltd», Китай), биохимический анализ крови проводился на автоматическом биохимическом анализаторе CS-Т240 («DIRUI Industrial Co., Ltd», Китай) с применением коммерческих биохимических наборов для ветеринарии ДиаВетТест (Россия).

Элементный анализ. Элементный состав биоматериалов (костная и мышечная ткани, шкура) исследовали на содержание 20 химических элементов (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, I, K, Mg, Mn, Na, Ni, P, Pb, Se, Sr, V, Zn). Использовали методы атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии (АЭС-ИСП и МС-ИСП) на оборудовании Elan 9000 (Perkin Elmer, США)

и Optima 2000 V (Perkin Elmer, США). Анализ образцов проводили в лаборатории АНО «Центра биотической медицины» (Registration Certificate of ISO 9001: 2000, Number 4017–5.04.06) [15].

Статистическая обработка. Статистический анализ результатов проводился при помощи пакета статистических программ Statistica 10, включая определение средней арифметической величины (М), стандартной ошибки средней (m), корреляционного анализа и методики ANOVA (дисперсионный анализ) [15]. Параметр Р < 0,05 как предел значимости.

Результаты и обсуждение

Кормление подопытных животных осуществлялось в соответствии с рекомендациями Института питания РАМН [10], все потребности в питательных веществах были восполнены за счет смеси витаминов.

Таблица 1.

Количество КОЕ/г, млн в кале крыс

Table 1.

The number of CFU / g, million in feces of rats

Образец Sample	ОМЧ TMN	Энтеробактерии Enterobacteria	Стафилококки Staphylococci	Бифидобактерии Bifidobacteria	Лактобактерии Lactobacilli	Сальмонеллы Salmonella
7 сут – к 7 day – control	0,65 ± 0,15	0,05 ± 0,02	0,31 ± 0,04	0,05 ± 0,01	0,36 ± 0,06	0,02 ± 0,01
7 сут – 5 мг 7 day – 5 mg	2,4 ± 0,35*	2,93 ± 0,1*	1,02 ± 0,08*	5,17 ± 0,05*	1,27 ± 0,16*	0,06 ± 0,6*
7 сут – 10 мг 7 day – 10 mg	2,1 ± 0,25*	0,09 ± 0,02	0,44 ± 0,04	6,54 ± 0,08*	1,10 ± 0,2*	0,05 ± 0,01
7 сут – 20 мг 7 day – 20 mg	1,32 ± 0,20	1,53 ± 0,06*	1,15 ± 0,05*	0,97 ± 0,03*	0,48 ± 0,07	0,05 ± 0,5*
14 сут – к 14 day – control	0,84 ± 0,06	0,05 ± 0,02	0,40 ± 0,02	0,03 ± 0,01	0,14 ± 0,04	0,01 ± 0,003
14 сут – 5 мг 14 day – 5 mg	1,60 ± 0,1	0,04 ± 0,01	0,92 ± 0,05	0,55 ± 0,15*	0,07 ± 0,04	0,09 ± 0,05
14 сут -10 мг 14 day – 10 mg	2,05 ± 0,05*	0,06 ± 0,02*	0,50 ± 0,01	5,07 ± 0,5*	0,71 ± 0,11	0,08 ± 0,2
14 сут – 20 мг 14 day – 20 mg	1,15 ± 0,05	0,16 ± 0,03	0,99 ± 0,03*	0,30 ± 0,02	0,04 ± 0,01	0,01 ± 0,003
Фон background	86,67 ± 10***	35,97 ± 4***	60,47 ± 10,5***	4,73 ± 0,4***	5,47 ± 2***	0,7 ± 0,1
*,** и *** – по сравнению с контролем *, ** and *** - compared to control

Как видно из таблицы, общее количество микроорганизмов выросло на 7-е сут по сравнению с контролем в 3,69; 3,23 и 2,03 раза для доз 5; 10 и 20 мг Fe соответственно. На 14-е сут динамика прироста уменьшилась и ОМЧ было выше контроля в 1,90; 2,44 и 1,36 раза. Но рост общей численности микроорганизмов не может четко охарактеризовать процессы, происходящие в кишечнике при даче НЧ. Таким образом, был произведен высев кала с целью оценки численности различных физиологических групп.

Группа энтеробактерий, включающая сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, клебсиеллы, собственно энтеробактер, серрации, протей, морганеллы, провиденции и иерсинии, в норме обитает в желудочно-кишечном тракте человека, но при снижении защитных свойств слизистой кишечника может вызывать инфекции желудочно-кишечного тракта или других органов. Энтеробактерии являются резидентными представителями нормальной фекальной флоры человека, при этом (наряду с Е. coli) Enterobacter, Klebsiella и Proteus составляют преобладающую часть факультативных анаэробов этой флоры. В эксперименте на 7-е сут опытные группы превосходили контроль по числу энтеробактерий: в 293 и 153 раза для доз 5 и 20 мг Fe соответственно. В то же время в группе, получавшей 10 мг железа, количество энтеробактерий не отличалось от контроля. Однако на 14-е сут количество энтеробактерий значительно уменьшилось по сравнению с контролем: так, при дозе 5 количество энтеробактерий меньше контроля в 1,25 раза, а для доз 20 мг выше в 3,2 раза. Количество стафилококков в образцах в группе 10 мг железа статистически не отличалось от контрольных значений.

Стафилококки являются частью нормальной микрофлоры кишечника. Однако при снижении иммунитета стафилококки могут активно размножаться, выделяя токсины, что ведет к развитию токсикоинфекций. В нашем эксперименте на 7-е день количество стафилококков было выше контроля в 3,29 и 3,7 раза для доз 5и 20 мг Fe соответственно. На 14-й день – в 2,3 и 2,4 раза выше для доз 5 и 20 мг Fe соответственно по сравнению с контролем. В группе, получавшей 10 мг железа, на 7-е и 14-е сут статистически значимых изменений отмечено не было. В целом наблюдалась динамика уменьшения количества КОЕ стафилококков на 14-й день в опытных группах по сравнению с 7-м днем.

Являясь доминирующей микрофлорой у здорового человека, бифидобактерии обеспечивают процессы обмена белков и жиров, участвуют в регуляции минерального обмена и синтезе витаминов групп В и К. Кроме того, бифидобактерии проявляют активность против патогенных штаммов, вырабатывая специфические органические кислоты антимикробного действия. Пониженное количество бифидобактерий может вызвать ферментативную, метаболическую и антитоксическую дисфункцию, а также нарушение колонизационной резистентности и иммунного ответа на патогенную микрофлору. В эксперименте отмечено преимущественное стимулирование роста количества бифидобактерий по сравнению с контролем в 103,4; 130,8 и 19,4 раза для доз 5; 10 и 20 мг Fe соответственно на 7-е сут. На 14-е сут количество КОЕ бифидобактерий было выше контроля в 18,3; 169 и 10 раз для доз 5; 10 и 20 мг Fe соответственно.

Лактобактерии являются облигатными представителями микрофлоры кишечника. На 7-е сут по сравнению с контролем наблюдали рост числа лактобактерий в 3,52; 3,05 и 1,33 раза для доз 5; 10 и 20 мг Fe соответственно. На 14-е сут по сравнению с контролем, наблюдали рост числа лактобактерий при дозе 10 мг в 5,07 раза, тогда как для дозы 5 и 20 мг наблюдали снижение числа лактобактерий в 2,0 и 1,75 раза соответственно, по сравнению с контролем.

Количество сальмонелл во всех опытных группах не превышало контрольных значений.

В литературе можно найти данные о том, что железодефицитная анемия способствует нарушению баланса микрофлоры в кишечнике.

Прием же препаратов, восполняющих дефицит железа, способствовал восстановлению нарушенного микробиоценоза кишечника [16].

Опираясь на литературные данные, стоит отметить, что железо (как и другие элементы) в наноформе обладает другими физико-химическими и биологическими характеристиками, в том числе более высокой биодоступностью и пролонгированностью действия.

При этом интенсивность процесса высвобождения металлов из наноформ ниже в сравнении с ионными формами, но это достоинство, которое позволяет рассматривать наночастицы металлов как выгодную альтернативу минеральным солям. Ранее это стало основанием для объяснения перспектив наноматериалов как источников микроэлементов в сравнении с солями. Относительно медленное высвобождение железа из наноформ может быть преимуществом при значительном поступлении источников железа в пищеварительный тракт, что наблюдается после абсорбции терапевтических доз растворимого железа [17]. Однако, исходя из трудоёмкости и нецелесообразности частого инъекционного введения препаратов железа, пероральный путь введения наночастиц, в том числе наночастиц железа, является предпочтительным.

Заключение

Периодичность дачи НЧ Fe животным с целью коррекции микробиоценоза при дефицитных диетах составляет 1 раз в 7 дней. При этом введение 10 мг железа на кг веса животного показало наилучшие результаты.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках научного проекта № 0743–2017–0002 (6.6811.2017/8.9) и Российского Фонда фундаментальных исследований № 18-316-00116 .