Микробные и химические риски использования органических удобрений на основе побочных продуктов животноводства

Побочные продукты агропромышленных животноводческих комплексов давно и широко применяются в качестве органических удобрений. В них в большом количестве концентрируются органические и минеральные вещества, которые, попадая в почву, увеличивают биомассу почвенной микробиоты и усиливают ее ферментативную активность [1, 2]. Объемы производства органических удобрений на ограниченных территориях, использование некомпостированных или «неправильно компостированных» удобрений обусловливают высокие риски микробного и химического загрязнения окружающей среды и, как следствие, риски здоровью населения, так как они могут содержать токсичные вещества, тяжелые металлы, биоциды, в том числе антибиотики, а также патогенные и условно-патогенные микроорганизмы [3].

Во всех странах существуют законодательные акты, регулирующие подготовку побочных продуктов животноводства к применению в качестве удобрения. Действующее законодательство РФ побочные продукты животноводства рассматривает как отходы и регламентирует обязательный контроль в отношении их микробного и химического загрязнения Федеральным законом от 14.07.2022 № 248-ФЗ «О побочных продуктах животноводства»1. В законодательных документах прописаны требования к хранению отходов, установлены нормативы содержания токсичных элементов, пестицидов и патогенных микроорганизмов. В обработанных и / или переработанных побочных продуктах животноводства нормируется содержание тяжелых металлов (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк), пестицидов (гамма-изомер гексахлорциклогексана – ГХЦГ и дихлорди-фенилтрихлорэтан – ДДТ), а также возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний. Эти показатели нормируются также в почве, в воде и в пищевой продукции, так как химические вещества / микроорганизмы могут переходить по пищевой цепи. В связи с этим обозначенную проблему следует рассматривать не только как экологическую или ветеринарную, но и медицинскую. Сегодня политика государства направлена на снижение до приемлемого уровня риска негативного воздействия опасных химических и биологических факторов, минимизацию рисков и интегрирование анализа риска здоровью в решении стратегических задач государственного социально-экономического развития [4].

В настоящее время большое внимание уделяется изучению вопросов распространения устойчивых к антибиотикам микроорганизмов, ассоциированных с сельскохозяйственной деятельностью человека [5–7]. Особую значимость представляет резистентность бактерий к антимикробным препа- ратам класса цефалоспоринов, так как эта группа входит в список антибиотиков ВОЗ, критически важных для медицины. Кроме того, продуктивные животные могут служить основным резервуаром для многих патогенов, таких как Campylobacter spp., non-Typhi серотипов Salmonella enterica, Listeria monocytogenes и шига-токсинпродуцирующих Escherichia coli, которые попадают в организм человека с продуктами питания [8–10]. Патогенный потенциал данных микроорганизмов определяется, в первую очередь, их способностью вырабатывать токсины, обусловливающие острые кишечные и тяжелые системные заболевания. Патогенные и условно-патогенные штаммы микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, циркулирующие в популяции крупного рогатого скота, могут попадать в органические удобрения, сохраняться там, что создает дополнительные риски здоровью населения.

Еще одной важной проблемой является загрязнение почв щелочными (Na, K), щелочноземельными (Ca, Mg) и тяжелыми металлами (Cu, Pb, Mn, Zn, Ni, Cd, Fe) [11]. Установлено, что присутствие тяжелых металлов в почве является фактором опасности для человека [12, 13]. Многочисленными исследованиями показано, что тяжелые металлы могут поглощаться из почв сельскохозяйственными растениями и таким образом продвигаться по цепям питания, что неизбежно приводит к их проникновению в организм человека [14–18]. Многолетнее внесение таких удобрений приводит к росту концентраций тяжелых металлов в сельскохозяйственных почвах, в ряде случаев до опасных уровней [14, 15, 18, 19]. Есть данные, что Cd, Cu, Zn, Pb и Ni, поступая в почву с удобрением, накапливались в овощах, в частности в редисе, что привело к повышению неканцерогенного риска для детей при его употреблении [15].

Показано, что неконтролируемое применение пестицидов и ряда хлорорганических соединений имело следствием контаминацию почв [20–23]. Для большинства соединений данной группы характерно свойство биомагнификации, то есть продвижение по пищевым цепям с накоплением на верхних трофических уровнях [24]. Мировым сообществом указано на опасность для здоровья человека хлорорганиче-ских соединений, таких как гамма-изомер гексахлорциклогексана (ГХЦГ), дихлордифенилтрихло-рэтан (ДДТ) и полихлорированных бифенилов (ПХБ) [25, 26]. Поступление пестицидов в организм сельскохозяйственных животных возможно с растительными кормами, полученными на загрязненных полях [24]. Так как данные соединения практически не подвержены разложению под действием ферментов животных, то велика вероятность их присутст- вия в побочных продуктах животноводства [26–28]. Использование таких органических удобрений может привести к распространению пестицидов на «чистых» территориях и последующему поступлению их в организм человека.

В Пермском крае функционируют несколько крупных промышленных животноводческих комплексов, а также многочисленные частные фермерские хозяйства, поэтому, как и в других регионах, проблема безопасности органических удобрений и возможных рисков для здоровья человека требует особого внимания.

Цель исследования – оценка микробного и химического загрязнения побочных продуктов животноводства разных сроков и условий хранения, а также анализ рисков здоровью населения.

Материалы и методы. Объектом исследования служили пробы органических отходов, полученные из трех крупных животноводческих хозяйств Пермского края (ООО «Агрофирма Труд», д. Кужлево (Х1), СПК «Хохловка», д. Скобелевка (Х2), ООО «Русь», с. Большая Соснова (Х3), по 4–8 проб из каждого хозяйства), с разными сроками и условиями хранения. Характеристика образцов для исследования представлена в табл. 1.

Оценка общей микробной обсемененности. Общее количество микроорганизмов (ОМЧ), в том числе представителей семейств Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae, определяли методом прямого высева последовательных децимальных разведений почвенных суспензий на универсальные и селективные агаризованные питательные среды. Навеску удобрения 1 г помещали в коническую колбу с 50 мл фосфатнобуферной среды (рН 7,0–7,2), взбалтывали и трехкрат- но дезинтегрировали ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц в ультразвуковой ванне Elma Ultrasonic 30S (Elma, Германия). Для подсчета ОМЧ использовали универсальную агаризованную среду Луриа – Бертани (LBА) (Becton, USA). Для определения энтеробактерий и псевдомонад – среды Endo agar (Becton, USA) и Pseudomonas CN agar (Conda S.A., Spain) соответственно. Ампициллиноустойчивые бактерии учитывали на универсальных и селективных средах с добавлением ампициллина (100 мкг/мл). Численность микроорганизмов определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) в пересчете на 1 г сухого удобрения. Выделение и идентификацию культур проводили традиционным методом.

Бактериологическое исследование на патогенные кишечные микроорганизмы ( Shigella, Salmonella ) проводили согласно СанПиН 3.3686-21². Расширенный скрининг возбудителей острых кишечных инфекций вирусной и бактериальной природы ( Adenovirus F, Astrovirus , Norovirus GII, Rotavirus A, Campilobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli (Enteroinvasive Escherichia coli – EIEC)) проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием набора «РеалБест-ОКИ» («Вектор-Бест», г. Новосибирск). Исследования проведены на базе ООО «Централизованная клинико-диагностическая лаборатория» (г. Пермь).

Оценку проб компостированных удобрений (со сроком хранения один год) осуществляли согласно Федеральному закону № 248-ФЗ: индекс БГКП (бактерии группы кишечной палочки), индекс энтерококков, наличие патогенных микроорганизмов, яиц и личинок гельминтов (экз./кг), цист простейших (экз./100 г) (ГОСТ 33379-20153, ГОСТ Р54001-20104

Таблица 1

Характеристика образцов органических отходов

№	Шифр	Срок хранения	Условия хранения	Локация*
1	Х1.1	1–3 дня (апрель, 2024)	н/п**	57.464644, 56.532670
2	Х2.1	1–3 дня (май, 2024)	н/п	58.231397, 56.291829
3	Х2.2	Один месяц (апрель, 2024 – май, 2024)	Аэробное / анаэробное хранение
4	Х2.3	12 мес. (май, 2023 – май, 2024)	Аэробное / анаэробное хранение
5	Х3.1	1–3 дня (май, 2024)	н/п	57.670633, 54.593398
6	Х3.2	Один месяц (апрель, 2024 – май, 2024)	Аэробное / анаэробное хранение
7	Х3.3	12 месяцев (май, 2023 – май, 2024)	Аэробное / анаэробное хранение

Примечание: * – координаты местоположения; ** н/п – не применимо; Х1, Х2, Х3 – хозяйства № 1, 2, 3 соответственно.

и ГОСТ 57782-20175). Исследования проведены на базе Государственного центра агрохимической службы «Пермский» ФГБУ.

Идентификация и типирование изолятов E. coli. Верификация изолятов E. coli проведена с помощью Микротест-системы «ENTEROtest 16». Методом ПЦР с помощью праймеров uidA-F/uidA-R, согласно L. Heijnen et al. [29], проведена детекция специфического фрагмента гена бета-глюкурони-дазы для определения принадлежности штаммов к виду E. coli . Типирование выделенных изолятов было проведено методом rep-ПЦР с праймерами ERIC1R/ ERIC2⁶.

Определение антибиотикочувствительности . Определение чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом с использованием агара Мюллера – Хинтон (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия) и дисков с антибиотиками (НИЦФ, г. Санкт-Петербург) согласно клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ, Версия-2018-03). Изучена чувствительность к следующим группам антибиотиков: бета-лактамам (ампициллину, цефоперазону, цефтриаксону, азтреонаму, меропенему), аминогликозидам (гентамицину, амикацину), фторхинолонам (ципрофлоксацину, левофлоксацину), а также к хлорамфениколу и тетрациклину. Индекс множественной антибиоти-корезистентности (MARI) для каждого изолята рассчитывали как отношение количества антибиотиков, к которым изолят был устойчив, к общему количеству протестированных антибиотиков по формуле (1):

MARI = а , (1) b где a – число изолятов, устойчивых к антибиотикам, b – общее количество изолятов7. Оценку совокупного индекса устойчивости к противомикробным препаратам (ARI) для выборки штаммов (из конкретного хозяйства) рассчитывали как соотношение между количеством устойчивых бактериальных изолятов и общим количеством протестированных комбинаций (количество антибиотиков · количество протестированных изолятов) согласно методу, предложенному P.H. Krumperman (1983)8, по формуле (2):

ARI = а , (2) b⋅c где a – совокупный показатель устойчивости к антибиотикам всех изолятов выборки, b – количество антибиотиков, c – количество изолятов в выборке.

Значение индекса 0,2 используется для дифференциации низкого и высокого риска для здоровья: ARI больше 0,2 предполагает, что штамм (-ы) бактерий происходят из среды с высоким уровнем загрязнения или использования антибиотиков [30].

Определение диареегенных патотипов E. coli . Методом ПЦР по конечной точке в штаммах E. coli детектировали гены, кодирующие токсины / энтеротоксины ( astA/east1 , estI/estA , estII/estB , eltA , stx1 , stx2 , eaeA ) и другие факторы патогенности диареегенных эшерихий ( subAB , ehxA , ipaH , ial ). Патотип энтероге-моррагических / продуцирующих шига-токсин E. coli ЕНЕС/STEC определяли по наличию stx1/2, exhA – генов шига-подобного токсина и энтерогемолизина соответственно. Патотип энтеротоксигенной E. coli (ЕТЕС) – по присутствию estI/estA , estII/estB – генов термостабильных и термолабильного энтеротоксинов соответственно. Энтероинвазивные E. coli (EIEC) определяли по плазмидному ( ipaH ) и хромосомному ( ial ) генам инвазивности, специфичным для Shigella spp. Энтеропатогенные E. coli (EРEC) – по генам eaeA (интимин) и exhA (энтерогемолизин). Ген astA/east1 энтероагрегатного термостабильного энтеротоксина 1 Escherichia coli (EAST1) часто присутствует в энтеро-агрегатной E. coli (EAEC), но может встречаться и у представителей других патотипов. Использовали праймеры и режимы амплификации, согласно рекомендациям авторов [31, 32]. Амплификацию проводили на термоциклере DNA Engine Dyad Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с помощью системы гель-документации Gel-DocXR (Bio-Rad, США).

Химический анализ на наличие металлов и органических загрязнителей. Экстракцию водорастворимых форм металлов проводили из 10 г образца органического отхода, суспендированного в 125 мл деионизированной воды. Суспензию пропускали через фильтр «синяя лента», фильтрат выпаривали до объема 50 мл при нагревании. После остывания до комнатной температуры фильтрат переносили в мерную пробирку, добавляли 2–3 капли концентри- рованной азотной кислоты и при необходимости доводили объем фильтрата до метки 50 мл деионизированной водой. В качестве стандартов для определения использовали ГСО 7330-96 (государственный стандартный образец раствора ионов металлов), содержащий алюминий, железо, кадмий, кобальт, магний, медь, молибден, никель, свинец, цинк. Анализ металлов осуществляли согласно РД 52.18.286-919 «Методика выполнения измерений массовой доли водорастворимых форм металлов в пробах почвы атомно-адсорбционным анализом» на атомно-адсорбционном спектрометре АА-6300 (Shimadzu, Япония).

Анализ органических удобрений на наличие пестицидов и полихлорированных бифенилов проводили методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием на газовом хроматографе 7010В с масс-селективным детектором 7890В (Agilent, США) при программировании температуры согласно T.I. Gorbunova et al. [33]. Экстракцию органических загрязнителей осуществляли согласно D.O. Egorova et al. [34]. Качественное содержание пестицидов в фильтрате оценивали по масс-спектрам выявленных соединений.

Расчет рисков здоровью населения. Для расчета канцерогенного и неканцерогенного рисков использовали модель, предложенную Агентством по охране окружающей среды США (US EPA, 2002¹⁰). Согласно данной модели был выбран сценарий поступления «не резидент», т.е. поступление происходит не в течение всей жизни, а только в рабочее время, пути поступления – дермальный и пероральный.

При расчетах неканцерогенного риска вычисляли коэффициент опасности (HQ) и индекс опасности (HI) согласно Руководству по оценке риска здоровью населения при воздействии химических веществ, загрязняющих среду обитания11, и US EPA (2002).

Коэффициент опасности ( HQ ) рассчитывали по формуле (3):

HQ i = ADI ni / RfD i             (3)

где ADI ni – суточное потребление отдельного металла при соответствующем пути поступления (мг/кг в день^-1), RfD i – референтная доза для каждого металла (мг/кг в день^-1) (табл. 2). При проведенных расчетах использованы значения RfD , указанные в Руководстве Р 2.1.10.3968-23.

Суточное потребление при пероральном и контактном пути поступления металлов в организм рассчитывали по формулам (4) и (5) соответственно:

ADI po =( C i · IR po · E · ED ) / ( BW · AT ) · 10^-6 , (4)

ADI der =( C i · ESA · SAF · DAF · E · ED ) /

( BW · AT ) · 10^-6,                (5)

где C_i – концентрация металла в исследуемом образце (мг/кг);

IR po – коэффициент перорального поступления (100 мг/сут);

E – частота воздействия (225 сут/год);

ED – длительность воздействия (25 лет – взрослые);

BW – вес тела (70 кг);

AT – среднее время воздействия (5625 сут);

ESA – площадь поверхности кожи, подвергающаяся воздействию (3300 см²);

SAF – фактор кожной адгезии (0,2 мг/см²);

DAF – фактор кожной адсорбции (0,001) (USEPA, 2002).

Таблица 2

Металл	Руководство Р 2.1.10.3968-23	US EPA, 2006	Wei et al., 2025	More, Dhakate, 2025	Pan et al., 2019
	перорально	перорально	перорально	перорально	перорально	дермально
Cu	0,04	0,04	0,04	0,371	0,02	5,4 · 10-3
Pb	1,5 · 10-4	0,004	0,0035	0,0035	1,4 · 10-3	5,25 · 10-4
Mn	0,14	–	–	–	–	–
Zn	0,3	0,3	0,3	0,3	4,0 · 10-2	1,2 · 10-2
Ni	0,02	0,02	0,02	0,02	2,0 · 10-2	8,0 · 10-4
Cd	0,0005	0,001	0,001	0,001	3,0 · 10-3	3,0 · 10-3
Fe	0,7	–	–	–	–	–

9 РД 52.18.286-91. Методика выполнения измерений массовой доли водорастворимых форм металлов (меди, свинца, цинка, никеля, кадмия, кобальта, хрома, марганца) в пробах почвы атомно-абсорбционным анализом: Руководящий документ. Методические указания / утв. Государственным комитетом СССР по гидрометеорологии, дата введения: 01.04.1991 [Электронный ресурс] // МЕГАНОРМ: система нормативных документов. – URL: Data2/1/4293783/ (дата обращения: 28.04.2025).

10 US EPA. Supplemental Guidance for Developing Soil Screening Levels for Superfund Sites [Электронный ресурс]. – Washington, DC: US EPA, Office of Emergency and Remedial Response, 2002. – 106 p. – URL: work/HQ/ (дата обращения: 28.04.2025).

11 Р 2.1.10.3968-23. Руководство по оценке риска здоровью населения при воздействии химических веществ, загрязняющих среду обитания / утв. Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения от 5 сентября 2023 г. [Электронный ресурс] // ГАРАНТ: информационно-правовое обеспечение. – URL: https:// (дата обращения: 28.07.2025).

Сравнение значений RfD для тяжелых металлов

Индекс опасности ( HI ij ) согласно Руководству Р 2.1.10.3968-23 рассчитывается по формуле (6) с учетом пути поступления ( i ) и органа / системы органов ( j ), на которую оказывается влияние:

HI ij = Σ HQ ij , (6)

где HI ij – индекс опасности, HQ ij – коэффициент опасности, вычисляемый для каждого металла в образце по формуле (3).

Индекс опасности < 1 свидетельствует об отсутствии неканцерогенного риска, при значениях HI > 1 риск считается значимым.

Канцерогенный риск оценивали на основании расчетов, проведенных по формуле (7), установленной в Руководстве Р 2.1.10.3968-23:

CR = LADD · SF · g , (7)

где LADD – среднесуточное потребление отдельного металла при соответствующем пути поступления (мг/кг в день^-1);

SF – «слоп»-фактор (при пероральном поступлении: Pb – 0,0085 мг/кг в день^-1, Cd – 0,38 мг/кг в день^-1);

g – коэффициент тяжести злокачественных новообразований; согласно Руководству Р 2.1.10.3968-23, значения g принимали за 1.

Суммарный канцерогенный риск ( TCR ) рассчитывали по формуле (8) согласно Руководству Р 2.1.10.3968-23:

TCR = Σ CR i , (8)

где CR i – канцерогенный риск для отдельного металла (8). Допустимыми приняты значения TCR в диапазоне 1·10^-6 – 1·10^-4.

Статистический анализ. Обработка данных проводилась с использованием компьютерных программ Microsoft Office XP Excel и GraphPad Prism Statistical Software. Показатели в таблицах представлены в виде среднего арифметического и его ошибки ( M ± m ). Для выявления статистически значимых различий между количественными показателями выборок определяли t -test Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. Оценка общей микробной обсемененности. ОМЧ в образцах побочных продуктов крупного рогатого скота варьировалось от 2,35·106 до 1,69·109 КОЕ/г сух. веса (табл. 3). В свежих отходах количество бактерий в среднем составило 4,60·108 ± 1,50·108 КОЕ/г сух. веса. Для данных образцов выявлена сильная отрицательная достоверная связь между массой сухого вещества и ОМЧ (rs = -0,915). После месяца хранения значение этого показателя увеличивалось (1,26·109 ± 4,09·108 КОЕ/г сух. веса), а после года хранения – снижалось (2,51·107 ± 1,14·107 КОЕ/г сух. веса). Статистически значимые различия выявлены между группами I и III (p = 0,039). По данным В.Г. Тюрина и соавт. [35], ОМЧ в образцах органических удобрений на основе навоза крупного рогатого скота, полученных после компостирования ор- ганического субстрата в термофильном режиме в течение 2 месяцев, составило 4,5·105 КОЕ/г, что отличается от полученных нами результатов.

Аналогичная тенденция отмечена для ампициллиноустойчивых бактерий на среде Pseudo-агар: по сравнению с I группой их среднее количество во II группе незначительно увеличивалось, а в III группе уменьшалось на два порядка. В пробах свежих побочных продуктов животноводства ампициллиноустойчивых представителей семейства Pseudomona-daceae не детектировали, однако после месяца и года хранения они были обнаружены в количестве 10³–10⁴ КОЕ/г сух. веса. При этом их доля выросла с 47,42 до 71,97 % от общего количества псевдомонад. Среднее число энтеробактерий на среде Эндо составило 6,37·10⁷ ± 4,40·10⁷ КОЕ/г сух. веса (ампициллиноустойчивых – 3,06·10⁷±1,97·10⁷; 32,38 %). Ожидаемо их количество снижалось с увеличением срока хранения удобрения.

Таким образом, показано, что побочные продукты животноводства содержат большое количество представителей семейств Enterobacteriaceae и Pseudomonadaceae , и, что особенно важно, во всех образцах отходов присутствуют ампициллиноустойчивые энтеробактерии.

Оценка встречаемости представителей патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Бактериологическое исследование образцов на наличие патогенных микроорганизмов (дизентерийная и тифо-паратифозная группы) и ПЦР-скрининг возбудителей острых кишечных инфекций ( Adenovirus F, Astrovirus , Norovirus GII, Rotavirus A, Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli (Enteroinvasive E. coli – EIEC)) показало следующее:

• –    в исследованных пробах роста шигелл не обнаружено;

• –    в единичных образцах свежих удобрений выявлены бактерии рода Salmonella Enteritidis ( n = 3), а также представители условно-патогенных бактерий Empedobacter brevis ( n = 2), Klebsiella pneumoniae ( n = 2), Klebsiella oxytoca , Aeromonas hydrophila , Citrobacter freundii , Citrobacter amalonaticus ( n = 2), Proteus mirabilis ( n = 4), Proteus vulgaris ;

• –    в большинстве образцов зафиксирован рост Aspergillus spp.;

  – результаты ПЦР-теста «Расширенный скрининг возбудителей острых кишечных инфекций» отрицательные. Следует отметить, что после года хранения органических отходов (оценено только для Х2 и Х3) санитарные показатели: индекс БГКП, индекс энтерококков, присутствие патогенных микроорганизмов, яиц и личинок гельминтов, цист простейших, регламентированные ФЗ № 248-ФЗ, соответствовали норме. При хранении и компостировании побочных продуктов в хранилище температура внутри бурта поднимается до 60–70 °С, что приводит к гибели большинства патогенных микроорганизмов.

Таблица 3

Содержание некоторых групп бактерий в пробах органических отходов

Группа: характеристика	Среднее количество микроорганизмов (клеток/г сух. веса), выросших на питательных средах:
	LB	LB+amp	Pseudo-агар	Pseudo-агар+amp	Эндо	Эндо+amp
Х1
I группа: свежий, сутки	6,51 · 108 ± 2,24 · 108	3,84 · 107 ± 2,31 · 107 5,57 %	0	0	1,27 · 108 ± 7,99 · 107	6,07 · 107 ± 3,47 · 107 32,33 %
Х2
I группа: свежий, сутки	2,29 · 108 ± 5,00 · 106	5,81 · 107 ± 4,98 · 105 18,14 % α	0	0	2,89 · 105 ± 9,09 · 104	9,96 · 103 ± 4,75 · 103 3,33 %
II группа: подстилочный, до одного месяца	7,42 · 108 ± 4,09 · 108	1,79 · 108 ± 1,26 · 108 19,12 %	9,74 · 103 ± 6,81 · 103	8,78 · 103 ± 1,00 · 102 47,41 %	9,17 · 107 ± 5,20 · 107	1,58 · 106 ± 8,34 · 105 1,69 %
III группа: компостированный, один год	2,35 · 106 ± 5,00 · 104	5,21 · 105 ± 5,00 · 103 18,15 %	3,91 · 103 ± 1,30 · 103	1,30 · 104 ± 5,00 · 102 76,88 %	7,36 · 105 ± 2,15 · 105	1,06 · 105 ± 4,56 · 103 12,59 %
Х3
I группа: свежий, сутки	1,94 · 108 ± 2,92 · 107	1,47 · 106 ± 6,97 · 103 0,75 %	2,80 · 103 ± 5,00 · 102	0	4,54 · 105 ± 1,88 · 105	5,61 · 105 ± 8,09 · 104 55,27 %
II группа: подстилочный, один месяц	1,69 · 109 ± 6,38 · 108	8,92 · 104 ± 4,27 · 104 0,005 %	0	0	6,40 · 105 ± 5,37 · 105	1,09 · 105 ± 1,94 · 103 14,55 %
III группа: компостированный, один год	3,65 · 107 ± 1,79 · 106	4,12 · 105 ± 2,71 · 104 1,11 %	7,40 · 103 ± 1,30 · 103	0	5,61 · 105 ± 3,08 · 104	4,20 · 105 ± 3,21 · 105 42,81 %
Итого (среднее по всем хозяйствам)
I группа: свежий, сутки	4,60 · 108 ± 1,50 · 108	3,07 · 107 ± 1,47 · 107 6,25 %	2,79 · 103 ± 2,67 · 102	0	6,37 · 107 ± 4,40 · 107	3,06 · 107 ± 1,97 · 107 32,38 %
II группа: подстилочный, один месяц	1,26 · 109 ± 4,09 · 108	9,95 · 107 ± 7,71 · 107 7,29 %	9,74 · 103 ± 6,81 · 103	8,78 · 103 ± 7,07 · 102 47,42 %	6,13 · 107 ± 3,81 · 107	1,09 · 106 ± 6,11 · 105 1,74 %
III группа: компостированный, один год	2,51 · 107 ± 1,14 · 107*˟	4,48 · 105 ± 3,96 · 104 1,76 %	5,07 · 103 ± 1,39 · 103	1,30 · 104 ± 5,00 · 102 71,97 %	6,49 · 105 ± 1,02 · 105	2,63 · 105 ± 1,59 · 105 28,84 %

Примечание: ^α – доля в соответствующей группе, %; * – достоверное отличие показателя от I группы; ˟ – достоверное отличие показателя от II группы ( t -тест); amp – ампициллин. LB – cреда Луриа – Бертани; Х1, Х2, Х3 – хозяйства № 1, 2, 3 соответственно.

Характеристика выделенных штаммов E. coli . Высокая доля эшерихиозов в общей структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота обусловила интерес к углубленному исследованию Е. coli . Лактозопозитивные культуры ( n = 112), изолированные на агаре Эндо, в дальнейшем верифицировали и типировали с помощью ПЦР. В результате из трех хозяйств получено 35 штаммов E. coli с индивидуальным генетическим профилем, у всех оценивали антибиотикоустойчивость и детектировали гены патогенности DEC.

Известно, что применение компоста сопряжено с риском распространения генов антибиотикорезистент-ности, содержащихся в бактериальном сообществе удобрения. Индекс множественной антибиотикорези-стентности является важным параметром для оценки факторов риска для здоровья населения. Принято считать, что источником бактерий с индексом ARI ≥ 0,2

являются хозяйства, где используется несколько классов антибиотиков. Общий индекс ARI для штаммов E. coli , выделенных из образцов побочных продуктов животноводства хозяйства «Труд» (Х1), составил 0,14, а хозяйства «Хохловка» (Х2) – 0,13. Индекс МARI двух культур из побочных продуктов третьего хозяйства («Русь») также не превышал 0,2. Интересно отметить, что в сравнении с исследованием T.P. Mthembu et al. [36], которые сообщили об индексе множественной антибиотикорезистентности в диапазоне значений от 0 до 0,875 (с преобладанием 0,31) у изолятов E. coli , выделенных от различных животных, включая овец, крупный рогатый скот, свиней, коз, кур и уток, ARI исследуемых нами E. coli оказался существенно ниже: 0,09–0,27. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о низком риске распространения антибиотикоустойчивых культур на данных предприятиях.

Данные о встречаемости в побочных продуктах животноводства диареегенных патотипов E. coli имеют решающее значение для оценки риска здоровью населения и необходимы для профилактических мер контроля их распространения [10]. Кроме того, показано, что эшерихии, в частности STEC, когда вносятся с загрязненными органическими удобрениями, могут выживать в почве в течение длительного времени. Принимая во внимание, что среди эшерихий встречаются как представители коммен-сальных сероваров, так и условно-патогенные и безусловные патогены [37, 38], в собранной коллекции определяли генетические маркеры DEC. Гены токсинов, а также энтеротоксинов – ehxA , subAB , stx1 , stx2 , estI/estA , estII/estB , eltA , eaeA – у всех исследованных штаммов E. coli обнаружены не были. Среди генов инвазии в большом проценте случаев (48,6 %) детектирован ial . Тем не менее ген инвазивного плазмидного антигена Н – ipaH , характеризующего EIEC, способных вызывать симптомы шигеллеза (бактериальной дизентерии) как у детей, так и у взрослых, не детектировали. Присутствие последнего необходимо для полного выражения патогенности, связанной с внедрением в эпителиальные клетки кишечника [38]. Только в двух культурах (5,7 %) выявлен ген энтероагрегативного термостабильного энтеротоксина EAST1, который связан с диарейны-ми заболеваниями человека и различных видов животных, включая крупный рогатый скот и свиней. Предполагается, что механизм действия EAST1 идентичен механизму действия термостабильного энтеротоксина, вызывающего увеличение циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Следует отметить, что ген astA/east1 присутствует не только в ДНК EAEC, но и других представителей диареегенных E. coli . Таким образом, в штаммах E. coli , выделенных из побочных продуктов животноводства трех хозяйств, детерминант специфических факторов, определяющих патогенез острых кишечных инфекций (за исключением генов ial и east1 ), не обнаружено . Важно отметить, что все культуры были чувствительны к большинству протестированных антибиотиков – общий индекс ARI не превышал 0,2.

Оценка содержания металлов. Установлено, что в побочных продуктах животноводства присутствуют металлы трех групп: щелочные, щелочноземельные и тяжелые (табл. 4). Образцы из хозяйства «Труд» (Х1) характеризуются высоким содержанием металлов щелочноземельной группы, но при этом в них выявлена самая низкая концентрация натрия. В остальных пробах концентрация щелочных металлов варьировалась в диапазоне 120–833 мг/кг, щелочноземельных – в диапазоне 52–376 мг/кг. Зависимости концентрации от периода хранения отходов не выявлено.

Существенный интерес представляет анализ тяжелых металлов как наиболее опасных загрязнителей окружающей среды. Установлено, что в образцах Х1 и Х3 присутствуют Mn, Zn, Ni, Cd и Fe (табл. 4). Однако их концентрации не превышали нормативные показатели, установленные как для побочных продуктов животноводства, так и для почв Федеральным законом № 248-ФЗ (2022), Постановлением Правительства РФ от 31 октября 2022 г. № 194012, СанПи-Ном 1.2.3685-2113, а также согласно X. Hao et al. [14]. В образцах Х2, помимо вышеперечисленных металлов, выявлено также наличие Cu и Pb (см. табл. 4). Количество свинца не превышает норм, установленных в РФ и ряде других стран для побочных продуктов животноводства и почв. Концентрация меди в РФ нормируется только для почв, тогда как в Евросоюзе и Канаде введены нормативы допустимого содержания меди в побочных продуктах животноводства (см. табл. 4). Сравнение полученных данных с нормативами показало, что концентрация Cu в образцах Х2 превышает предельно допустимые концентрации (ПДК) для почв, что может осложнить применение данных продуктов в качестве удобрений. Интересно отметить, что в результате хранения концентрации Pb, Cd в образцах Х2, Mn и Zn в образцах Х3 увеличиваются. Напротив, количество Mn и Zn в пробах Х2 и Ni в пробах Х3 снижается в течение годичного периода хранения. Изменения уровней Cu и Fe не коррелировали с периодом хранения. В работе X. Hao et al. [14] показано, что в процессе компостирования навоза происходит концентрирование тяжелых металлов. Однако в настоящем исследовании мы наблюдаем разнонаправленный процесс изменения содержания металлов в процессе компостирования.

Оценка рисков здоровью населения, связанного с применением удобрений . Анализ коэффициентов опасности тяжелых металлов в зависимости от пути воздействия на организм человека показал, что применение органических удобрений приводит к некоторому повышению концентрации тяжелых металлов в почвах, однако это не сказывается на значениях неканцерогенного риска. Значения коэффициентов опасности ( HQ ) для разных металлов, идентифицированных в образцах побочных продуктов животноводства,

Таблица 4

Концентрация металлов (ppm) в исследованных образцах побочных продуктов животноводства и нормы содержания тяжелых металлов* (ppm = мг/кг)

Образец	Тяжелые							Щелочные		Щелочноземельные
	Cu	Pb	Mn	Zn	Ni	Сd	Fe	Na	К	Са	Мg
Х1.1	н.д.**	н.д.	2,97 ± 0,08	3,82 ± 0,04	0,51 ± 0,01	0,26 ± 0,01	12,57 ± 0,02	84,00 ± 0,03	527,49 ± 0,01	630,05 ± 0,01	216,54 ± 0,04
Х2.1	6,91 ± 0,01	0,69 ± 0,01	2,59 ± 0,05	2,72 ± 0,02	0,87 ± 0,02	0,05 ± 0,03	н.д.	120,94 ± 0,04	416,94 ± 0,01	256,41 ± 0,01	110,57 ± 0,01
Х2.2	8,25 ± 0,01	2,06 ± 0,08	2,20 ± 0,03	1,10 ± 0,01	1,18 ± 0,01	0,05 ± 0,03	3,51 ± 0,05	120,02 ± 0,02	710,70 ± 0,02	362,31 ± 0,01	101,76 ± 0,05
Х2.3	7,95 ± 0,02	2,52 ± 0,05	0,60 ± 0,01	0,66 ± 0,06	0,67 ± 0,02	0,11 ± 0,01	н.д.	120,65 ± 0,01	176,88 ± 0,05	288,46 ± 0,02	52,15 ± 0,04
Х3.1	н.д.	н.д.	0,94 ± 0,01	1,28 ± 0,06	0,96 ± 0,03	н.д.	4,74 ± 0,01	123,42 ± 0,04	502,22 ± 0,02	189,52 ± 0,01	100,19 ± 0,01
Х3.2	н.д.	н.д.	2,07 ± 0,03	1,93 ± 0,02	0,79 ± 0,05	н.д.	3,48 ± 0,02	131,12 ± 0,06	494,33 ± 0,03	356,74 ± 0,04	152,45 ± 0,01
Х3.3	н.д.	н.д.	3,29 ± 0,02	2,63 ± 0,03	0,59 ± 0,04	0,05 ± 0,03	6,44 ± 0,01	128,71 ± 0,06	833,89 ± 0,01	376,25 ± 0,04	116,93 ± 0,01
Допустимая концентрация (нормирование) побочные продукты животноводства
РФ (почвы)	3	6–32	60–700	23	4		н.н.	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.
РФ		130				2	н.н.***	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.
Китай		50				3	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.
Евросоюз	300	120		800		1,5	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.
Канада	100	150		500		3	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.	н.н.

Примечание: * – по Федеральному закону № 248-ФЗ, 2022, Постановлению Правительства РФ от 31 октября 2022 г. № 1940, СанПиНу 1.2.3685-21, по X. Hao et al. [14]; ** н.д. – концентрация ниже минимальной детектируемой ( < 0,125 ppm); *** н.н. – не нормируются.

а

б

Рис. 1. Индекс опасности (HI) при использовании в качестве удобрения образцов Х2.3 и Х3.3: а – при пероральном пути поступления; б – при дермальном пути поступления находились в диапазоне 0,004÷0,0000008, что характеризует риск как пренебрежимо малый. Таким образом, полученные результаты подтвердили, что внесение годичных удобрений в хозяйствах не приведет к неприемлемым уровням риска здоровью работников.

Сравнение индекса опасности при пероральном и дермальном путях поступления показало, что все рассчитанные риски находятся в приемлемом диапазоне (рис. 1). Канцерогенный риск был рассчитан с учетом содержания в образцах годичных удобрений Cd и Pb при пероральном пути поступления (рис. 2).

Рис. 2. Канцерогенный риск по отдельным металлам и суммарный канцерогенный риск ( TCR ) при использовании в качестве удобрения образцов Х2.3 и Х3.3

Значение показателя канцерогенного риска находилось в диапазоне 10–6–10–4, т.е. риск характеризовался как приемлемый, низкий. При этом, в отличие от исследований S. More et al. [13], доля кадмия в показателе канцерогенного риска была выше, чем доля свинца.

В целом выполнение оценки рисков здоровью представляется целесообразной процедурой, обеспечивающей доказательность безопасности применения удобрений [39].

Оценка хлорорганического загрязнения. Во всех исследованных образцах побочных продуктов животноводства не выявлено присутствие хлорорга-нических пестицидов (ГХЦГ, ДДТ) и полихлорированных бифенилов (ПХБ). ГХ-МС-анализ показал, что образцы содержали только продукты липидного и белкового обмена, которые не представляют угрозу для здоровья человека.

Установлено, что побочные продукты крупных животноводческих хозяйств Пермского края через год хранения являются безопасными в микробном и химическом отношении и могут быть использованы как удобрения. Это подтверждается тем, что санитарные показатели (индекс БГКП, индекс энтерококков, присутствие патогенных микроорганизмов, яиц и личинок гельминтов, цист простейших) не превышали нормативы, а также отсутствием в образцах удобрений диареегенных эшерихий патотипов EHEC/STEC и EIEC, низкими значениями индексов MARI и ARI как для отдельных штаммов E. coli, так и в популяции, характеризующими риск распространенности микробной антибиотикоустой-чивости, и отсутствием хлорорганических пестицидов (ГХЦГ, ДДТ) и полихлорированных бифенилов (ПХБ). Кроме того, индекс опасности тяжелых металлов был в пределах допустимого.

Тем не менее следует отметить, что в свежих отходах содержание ампициллиноустойчивых колиформных бактерий выше допустимых пределов, и хотя их количество уменьшалось со сроком хранения, нельзя исключить их возможное влияние на структуру ре-зистома в почве. Важно отметить, что в отходах в течение одного месяца могут сохраняться бактерии рода Salmonella , а также представители условно-патогенных энтеробактерий. Что касается содержания тяжелых металлов, то показано, что концентрации некоторых металлов в ряде свежих и месячных образцов превышают ПДК (для почв), что может осложнить применение данных продуктов в качестве удобрений.

Выводы:

• 1.    На основе данных бактериологического анализа выявлено, что в побочных продуктах животноводства со сроком хранения не более месяца содержание колиформных бактерий выше допустимых пределов, встречаются также патогенные ( Salmonella enterica non-Typhi) и условно-патогенные микроорганизмы родов Klebsiella , Aeromonas , Citrobacter , Proteus и др. В то же время все микробиологические показатели в годичных удобрениях соответствовали нормативам.

• 2.    Субпопуляции E. coli , выделенные из побочных продуктов, не содержали гены диареегенных патотипов эшерихий ( cnf1 , ehxA , subAB , stx1 , stx2 , estI/estA , estII/estB , eltA , ihaH ), за исключением ial и astA/east1 . Общий индекс множественной антибиоти-коустойчивости для штаммов E. coli , выделенных из образцов побочных продуктов животноводства, не превышал 0,2, что свидетельствует о низком уровне использования антибиотиков в данных хозяйствах и малом риске развития антибиотикоустойчивости и ее распространения в настоящее время.

• 3.    Установлено, что в двух хозяйствах доминантным загрязнителем является Fe (12,5 мг/кг и 3,5–8,3 мг/кг соответственно в Х1 и Х3), а в одном – Cu (6,9–8,3 мг/кг). Абсолютные величины коэффициентов и индексов неканцерогенного и канцерогенного рисков свидетельствуют о приемлемом уровне рисков здоровью и безопасности применения данных удобрений.

• 4.    Во всех исследованных образцах побочных продуктов животноводства присутствие хлорорга-нических пестицидов (ГХЦГ, ДДТ) и полихлорированных бифенилов (ПХБ) не выявлено. Установлено, что в отходах содержались только продукты липидного и белкового обмена, не представляющие риска для здоровья человека.

• 5.    Компостированные побочные продукты со сроком хранения один год крупных животноводческих хозяйств Пермского края являются безопасными в микробном и химическом отношении и могут быть использованы в дальнейшем в качестве удобрения.

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда и Пермского края № 24-24-20048¹⁴.