Микросателлитные локусы как маркеры для идентификации и сертификации линий и гибридов подсолнечника селекции ВНИИМК

Подсолнечник является основной масличной культурой в нашей стране и одной из важнейших культур в мире. Увеличение количества новых гибридов, которые интенсивно производятся во всем мире, вызывает потребность контроля генетического разнообразия исходного материала для эффективного подбора родительских пар, тестирования однородности коммерческих партий семян и идентификации селекционного материала для защиты авторских прав селекционеров. Такие проблемы, как контроль генетической чистоты коммерческих партий семян двух- и трехлинейных гибридов, а также их родительских форм успешно решаются с использованием электрофореза запасных белков семян и изоферментов (Попереля и др., 2002; Туркав и др., 1996). Недостатком таких маркеров является их ограниченное число и органоспецифичность. Так, анализ 32 инбредных линий подсолнечника отечественной селекции по семи изоферментным системам показал, что они распределились в 24 группы, отличающиеся друг от друга. При чем нередко в одну и ту же группу попадали образцы, имеющие разное происхождение (Гучетль и др., 2004).

Удобным инструментом для идентификации генотипов является анализ полиморфизма амплифи-цированных микросателлитных (SSR) последовательностей ДНК. Микросателлитные локусы, в основном, являются некодирующими участками ДНК, и, следовательно, не подвергаются действию естественного отбора. Здесь могут накапливаться мутации, что обусловливает высокий полиморфизм этих зон. Чаще всего они обладают кодоминантным типом наследования. Такие простые повторы широко распространены в геномах растений, в том числе в генных локусах (Чесноков, 2005; Brown et al.,1996). SSR-маркеры позволяют идентифицировать разнородный сортовой материал, устанавливать филогенетические связи между видами растений, вычислять генетические дистанции между сортами для подбора родительских пар (Кудрявцев и др., 2004; Хлесткина и др., 2004). Тангом и соавторами выявлено и секве-нировано несколько сотен микросателлитных локусов подсолнечника и фланкирующих их последовательностей, комплементарно которым были сконст- руированы праймеры для амплификации этих зон (Tang et al., 2002). В том же году аргентинские ученые изолировали и охарактеризовали 170 полиморфных микросателлитных локусов ДНК этой культуры (Paniego et al., 2002). Эти работы позволили установить частоту нахождения различных SSR-локусов в геноме подсолнечника и использовать их для идентификации генотипов (Солоденко и Сиволап, 2005).

Цель нашей работы – определение степени поли-морфности, типа наследования аллельных вариантов 10 известных микросателлитных локусов, оценка возможности использования полученных ДНК спектров для идентификации и сертификации линий и гибридов подсолнечника селекции ВНИИМК и вычисление уровней сходства между инбредными линиями отечественной селекции.

Материалы и методы. Следующие семнадцать инбредных линий и две гибридные комбинации селекции ВНИИМК были использованы нами для генетических исследований: ВК 639, ВК 464, ВК 541, ВК 571, ВК 157, ВК 678, ВК 276, ВК 580, ВК 653, ВК 910, ВК 937, BK 680, ВК 789, ВК 551, ВК 585, ВК 876, ВА 93, F 1 (ВК 678 × ВК 464), F 1 (ВК 678 × ВК580).

ДНК была выделена из 5-7-дневных этиолированных проростков подсолнечника по модифицированному методу Saghai-Maroof (Saghai-Maroof et al., 1984) Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 50 мМ KCl, 16,6 мM сульфата аммония; 2,5 мM MgCl2, 0,01 % Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 единицу рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Москва, ГОСНИИГЕНЕТИКА). Амплификацию проводили в приборе Терцик (ДНК-технология, Россия). Температурный режим реакций подбирали для каждой пары праймеров с учетом их нуклеотидного состава. Для большинства проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 96 оС в течение 2 мин, затем 30 циклов при соблюдении температурновременного режима: денатурация при 94 оС – 30 с, отжиг при 60 оС в течение 40 с, элонгация – 1 мин при 70 оС, финальная элонгация – 2 мин. Только для праймера HNCA-2 была использована температура отжига 55 оС.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2 % агароза, 1х ТАЕ-буфер) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE.1, ДНК-технология, Россия) в течение 1,0-1,5 ч при силе тока 58 mA и напряжении 90100 V. Документирование результатов электрофореза обеспечивалось при помощи трансиллюминатора и видеосистемы (ДНК-технология, Россия) с программным обеспечением Gel Imager-2.

SSR анализ был выполнен с десятью парами праймеров, сконструированных Tang et al. (2002) и Paniego et al. (2002). В таблице 1 представлено описание исследованных микросателлитных локусов.

Таблица 1 – Характеристика изученных микросателлитных локусов

Локус	Повтор	Последовательность праймера 5’-3’	Количество аллелей
Ha 432	GT	CTT TAT CCC CCA CCC CCT CC GGG TTT AGT GGC CAG TAG TTG TC	3
Ha 514	GA	GGT CAA CGG ATT TAG AGT C GTA TTG ATT CCA ACA TCC AG	2
Ha 1327	ATT	CCG TTA GGT AGT TTA CTT GCG AC GGT GGG GGG AAT ATT CTG AGG TG	2
Ha 1442	ATT	GCT TAT GTG CTT ACG TGT TCC TG CTA AAC AGT TCG GCG AGT GTA GG	2
Ha 1608	ATT	GAT CTT AGG TCC GCC AC GAT GGC ATT TGG CTA GAC	3
ORS-6	AGG	GTG GAG AGA GGT GTA GAG AGC CAC CCC TCA CCC TGA CAC	2
ORS-5	AAC	ATC TGG AGC AGC AAA TTC AG CTG CTG CCC ACC ATA CTG	3
IUB-6	GT	TCG GTA TCG TTT GCT AAT GG GGT AAC TCT AAA GCT CTG TC	2
HNCA-2	GT	TGA GAC AAG CAT AAG CAC TAG ACA AGA CAA GGG ACT	2
IUB-3	TTTTTTTG	GCA TTA GGT AGA TAG CCC CAG GTG GTA CCC TCA CTA GTC CTC T	1

Исследуемые инбредные линии оценивали на генетическую однородность, используя для их последующей идентификации ДНК проростков, типичных для данного генотипа. ДНК, выделенная из проростков линий ВК 580 и ВК 678, наряду с маркером молекулярного веса, использовалась во всех проведенных полимеразных цепных реакциях в качестве контроля для оценки длины амплифицированных фрагментов.

Результаты и обсуждение. Для достоверной идентификации генотипов необходимо использовать оптимальное количество локусов с максимальным числом аллелей и хорошо читаемыми маркерными спектрами. Наиболее оптимальным для молекулярно-генетической характеристики культивируемых сортов растений является использование 1-3 маркеров на хромосому. Но, как правило, увеличение числа микросателлитных маркеров на один сорт приводит к более подробному молекулярно-генети- ческому описанию исследуемого образца, но особенно не влияет на эффективность идентификации сортов (Хлесткина и др., 2004). А для определения генетической чистоты инбредных линий необходимо использование четырех микросателлитных локусов и лишь одного для определения уровня гибридности у гибридов (Сиволап, Солоденко, 2004). В связи с этим для характеристики отечественных линий и гибридов подсолнечника мы оценили аллельное разнообразие 10 микросателлитных локусов и типы их наследования. Количество полученных аллелей для различных локусов варьировало от 1 до 3 (см. табл. 1), среднее число аллелей на локус составило 2,2 (без учета мономорфных локусов). Этот показатель соответствует количеству аллелей на локус, полученному зарубежными авторами на другом наборе микросателлитных маркеров. В работе Солоденко с соавторами (Солоденко и др., 2003), при идентификации 20 ин-бредных линий подсолнечника из трех основных центров создания генетического материала данной культуры в Украине, выявлено в среднем по 3 аллеля на один микросателлитный локус. При изучении коллекции инбредных линий подсолнечника из трех мировых центров селекции было установлено, что 170 полиморфных микросателлитных локусов продуцируют в среднем 3,5 аллеля на локус внутри исследованной группы, включающей 16 инбредных линий (Paniego et al., 2002).

Выявленные нами аллели были обозначены буквами латинского алфавита. Гетерозиготные спектры, т.е. спектры, в которых присутствовали фракции двух разных аллелей, в таблице обозначены двумя буквами (табл. 2, 3). Информативность микросателлитных локусов оказалась различной. Локус IUB 3 для инбредных линий оказался мономорфным. Последующее его использование в паспортизации инбред-ных линий подсолнечника мы сочли нецелесообразным. Наибольшее аллельное разнообразие проявляли локусы На 1608 и ORS-5. Двумя аллельными состояниями у изученных генотипов характеризовались 7 локусов: Ha 432, Ha 514, Ha 1327, Ha 1442 и IUB-6, ORS-6, HNCA 2 (рис. 1).

Рисунок 1 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК у линий подсолнечника по локусу Ha 514. a, b – аллели локуса Ha 514, М – маркер молекулярного веса 1 kb (фракция 250 п.н.).

спектры, которые хорошо воспроизводи-

Таблица 2 – Идентификация линий подсолнечника с помощью микросателлитных маркеров

Линия	Локус
	На 432	На 514	На 1327	На 1442	На 1608	ORS-6	ORS-5	IUB 6	HNCA 2
ВК 639	а	b	а	0	c	-	c	a	a
ВК 464	b	а	b	0	b	a	a	a	a
ВК 541	a	а	а	a	c	a	a	a	a
ВК 571	b	b	b	0	b	a	a	a	a
ВК 157	b	b	b	0	b	a	c	a	b
ВК 678	а	b	а	0	b	a	b	a	a
ВК 276	b	а	b	a	b	a	c	b	b
ВК 580	b	а	а	a	c	a	a	a	b
ВК 653	-	а	b	0	a	a	a	a	b
ВК 910	а	b	b	a	b	a	b	a	b
ВК 937	а	а	а	0	c	a	c	b	b
ВК 680	b	b	а	0	a	b	c	a	a
ВК 789	b	а	b	a	b	a	-	a	-
ВК 551	b	b	b	a	a	a	b	a	a
ВК 585	а	аb	а	a	b	a	b	a	a
ВК 876	а	b	b	0	b	b	b	a	b
ВА 93	а	аb	b	-	c	b	c	a	b

лись при повторных анализах. Размер ампликонов составлял от 100 до 250 п.н. При анализе электрофоретических спектров 17 линий выявлена индивидуальность аллельного состава каждой из них. Девять пар праймеров выявили поли морфизм у всех исследованных линий. Таким образом, установлена возможность использования указанных микроса-

Генотип по локусу Ha 432, обозначенный как b, был представлен двумя фракциями с различной интенсивностью, где более интенсивная фракция по количеству пар нуклеотидов равна аллелю а (рис. 2). Этот генотип мы считаем гомозиготным, поскольку при самоопылении линий расщепления по данному признаку не происходило. При использовании пары праймеров Ha 1442 амплифицировались два микро-сателлитных локуса. В таблице 2 представлены данные по одному из них Ha 1442-1. Наследование ампликонов в этом локусе происходило по принципу наличие – отсутствие фракции, т.е. один аллель был представлен нуль-вариантом (обозначен 0) (рис. 3).

Рисунок 2 – Электрофоретический спектр продуктов амплификации ДНК у линий и гибридов подсолнечника по локусу На 432. a, b – аллели локуса На 432, М – маркер молекулярного веса 1Kb (фракция 250 п.н).

Рисунок 3 – Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК у линий и гибридов подсолнечника по локусу Ha 1442-1. a, 0 – аллели локуса Ha 1442-1, М – маркер молекулярного веса 1 kb (фракция 250 п.н.).

По всем 10 SSR-локусам получены четкие, характерные для микросателлитов, электрофоретические теллитных локусов в качестве маркеров для иденти-тификации линий селекции ВНИИМК и составления их молекулярно-генетических паспортов.

В селекции гибридов подсолнечника для повышения уровня семеноводства необходимо проводить оценку степени гибридности семян. В случае кодоминантного наследования молекулярно-генетический маркер удобен для оценки этого параметра в процессе селекции и тестирования генетической чистоты коммерческих партий семян гибридов. Для определения типа наследования изученных локусов были проведены индивидуальные скрещивания между растениями линий ВК 678 и ВК 580, контрастными по аллельному состоянию локусов Ha 432, Ha 514, Ha 1442-1, Ha 1608, ORS-5. Также выполнены скрещивания между линиями ВК 678 и ВК 464, оцененными как контрастные по аллельному состоянию локусов Ha 432, Ha 514, Ha 1327, Ha 1442-1, ORS-5. Семена F1 использовали для анализа ДНК гибридных растений. Получено и проанализировано расщепление потомства F2.

Спектры амплифицированной ДНК линий ВК 678, ВК 580, ВК 464 и гибридов между ними подтверждали кодоминантное наследование локусов Ha 514, Ha 1608, На 1327 и ORS-5 (табл. 3). У гибридов присутствовали как отцовская, так и материнская фракции (рис. 4). Следует отметить, что среди продуктов амплификации локусов Ha 514 и Ha 1327 наблюдалось преобладание интенсивности фракции b отцовской формы ВК 580.

Рисунок 4 – Электрофоретический спектр продуктов амплификации ДНК у линий и гибридов подсолнечника по локусу ORS-5. a, b – аллели локуса ORS-5, М – маркер молекулярного веса 1 kb (фракция 250 п.н.).

По характеру спектров продуктов амплификации в F 2 проростки разделились на три группы: спектр линии ВК 678, спектр линии ВК 580 и гибридный спектр для первой комбинации и спектр линии ВК 678, спектр линии ВК 464 и гибридный спектр для второй комбинации. Наличие трех видов спектров (двух родительских и одного гибридного) в расщепляющемся потомстве F 2 подтверждает вывод о кодоминантном типе наследования данных микро-сателлитных маркеров у подсолнечника. Это дает возможность использовать анализ аллельного состава перечисленных локусов для оценки уровня гиб-ридности семян Fı. Для локусов Ha 432 и Ha 1442-1 выявлено доминантное наследование аллельных вариантов, поскольку у гибридов воспроизводился лишь один из родительских спектров, что не позволяло устанавливать гибридность (см. рис. 2, 3).

Таблица 3 – Аллельные состояния микросателлитных локусов родительских линий и гибридов подсолнечника

Линия гибрид	Локус
	На 432	На 514	На 1327	На 1442-1	На 1608	ORS-6	ORS-5	IUB 6	HNCA 2
ВК 678	а	b	а	0	b	a	b	a	a
ВК 580	b	а	а	a	c	a	a	a	b
ВК 464	b	а	b	0	b	a	a	a	a
ВК678×ВК580	b	ab	a	a	bc	a	ab	a	a
ВК678×ВК464	b	ab	ab	0	b	a	ab	a	a

Маркеры, находящиеся в гомозиготном состоянии, не позволяют устанавливать уровень гибридно-сти, но их можно использовать как для идентификации гибрида, так и для определения наличия примесей. Примеси, попадающие в партию семян гибрида механическим путем или в результате переопыления чужеродной пыльцой, будут иметь другой генотип, который можно выявить сравнением их молекулярно-генетических паспортов. Рассмотренные в настоящей работе маркеры можно использовать не только для идентификации и паспортизации линий, но и для оценки однородности семян гибридов и доли примесей в них самоопылен-ных материнских форм. Это удовлетворяет современным требованиям по совершенствованию селекционно-семеноводческой работы и интеграции в международную систему UPOV.

На основании полиморфизма девяти SSR-локусов была составлена дендрограмма для 17 исследованных инбредных линий подсолнечника (рис. 5).

При построении дендрограммы использовалась треугольная матрица нормированных Евклидовых расстояний по алгоритму «дальний сосед». Уровни сходства (S1, 2) между двумя генотипами рассчитывались по следующей формуле:

S1, 2= 1-Е1, 2, где Е1, 2 – нормированное Евклидово расстояние между первым и вторым образцами.

Вычисления проводились с помощью компьютерной программы «Граф-анализ» (Воробьев, 2005).

Принимая за достоверные различия на уровне сходства 0,5, дендрограмму можно разделить на 3 кластера. Кластер I включает линии ВК 464, ВК 571, ВК 653, ВК 789, ВК 551, кластер II – ВК 639, ВК 678, ВК 680, ВК 541, ВК 580, ВК 585, кластер III – ВК 167, ВК 876, ВК 910, ВА 98, ВК 276, ВК 937. Максимальный уровень сходства между генотипами составил 0,97, минимальный – 0,19.

Интересно, что при группировке линий в кластеры в различные кластеры попадают линии ВК 571 (кластер I) и ВК 175 (кластер III) и линии ВК 678 (кластер II) и ВК 876 (кластер III). Эти пары линий являются аналогами, т.е. несут различия по 1-2 хозяйственно ценным признакам. Возможно, некоторые используемые нами локусы (локус ORS-5 для пары линий ВК 571 и ВК 175 и локусы Ha 1327, ORS-6 и HNCA 2 для ВК 678 и ВК 876) могут находиться в одной группе сцепления с генами, контролирующими данные хозяйственно ценные признаки. Это помогает не только различать эти близкородствен ные линии, но и относить их к разным кластерам.

Заключение. В результате  прове денных исследова ний было выявлено, что из 10 изученных нами мик-росателлитных локусов 9 являются полиморфными. Среднее количество аллелей на локус для 17 селекционных линий ВНИИМК составило 2,2. С использованием полиморфных локусов были составлены молекулярно-генетические паспорта и установлена уникальность каждой инбредной линии и гибридной комбинации. Проведенный гибридологический анализ показал, что два локуса из 9 – Ha 432 и Ha 1442-1 наследуются по доминантному типу. Остальные 7 – по традиционному для микросателлитов кодоминантному типу, что позволяет с их помощью устанавливать уровень гибридности при скрещивании линий. Таким образом, использование изученных микросателлитных локусов целесообразно для идентификации и сертификации линий и гибридов подсолнечника селекции ВНИИМК.

По результатам паспортизации 17 инбредных линий по 9 SSR-локусам был проведен кластерный анализ и построена дендрограмма. При уровне сходства между линиями от 0,19 до 0,97 выявлена уникальность каждой из них и гибридных комбинаций. Составлены их молекулярно-генетические паспорта на основе 9 локусов. Показана их пригодность для оценки генетической чистоты коммерческих партий семян подсолнечника. Семь кодоминантных локусов пригодны для определения уровня гибридности.

Исследования выполнены при частичной финансовой поддержке РФФИ и Администрации Краснодарского края, проект № 06-04-96757.

Уровень сходства

I

II

III

ВК464

ВК571

ВК653

ВК789

ВК551

ВК639

ВК678

ВК680

ВК541

ВК580

ВК585

ВК157

ВК876

ВК910

ВА93

ВК276

ВК937

Рисунок 5 – Дендрограмма линий подсолнечника селекции ВНИИМК, построенная на основе аллельного разнообразия 9 микросателлитных локусов