Микротрансплантация гаплоидентичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови при острых миелоидных лейкозах

В течение длительного времени возможность аллогенных иммунокомпетентных клеток индуцировать иммунный ответ в организме хозяина изучалась на животных [12, 13]. В этих исследованиях было продемонстрировано улучшение выживаемости лабораторных животных после введения аллогенных клеток посредством активации клеток хозяина. В других экспериментах наличие противоопухолевого ответа сохранялось без длительного приживления и после утраты химеризма [14, 15]. Мышам проводились аллогенные трансплантации после кондиционирования циклофосфамидом, моноклональными антителами к C 4 и C 8, облучением тимуса с достижением смешанного химеризма. Инфузия донорских лимфоцитов приводила к достижению полного химеризма, а инфузия лимфоцитов реципиента к его полной утрате, однако все равно имел место противо-пухолевый эффект.

Подобный эффект был описан при сочетанной трансплантации ГСК и почки от HLA-совместимого сиблинга у пациентки с множественной миеломой и терминальной стадией почечной недостаточности. После немиелоаблативного кондиционирования был достигнут смешанный химеризм, который был утрачен после дня 100. Иммуносупрессивная терапия была отменена, однако отторжения трансплантата почки не последовало, и пациентка длительное время находилась в состоянии полной ремиссии по основному заболеванию [16]. Возможность достижения ремиссии несмотря на утрату химеризма была продемонстрирована при проведении аллоТГСК с немиелоаблативным кондиционированием с последующим введением донорских лимфоцитов у пациентов с продвинутыми стадиями гемобластозов [17–19].

Результаты экспериментов на животных и полученные клинические данные привели к появлению исследований, целью которых является достижение противоопухолевого ответа без длительного приживления трансплантата. Содержание менее 1 % клеток донора в периферической крови реципиента в таких работах называется микрохимеризмом. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток после немиело-аблативного кондиционирования с целью достижения микрохимеризма называется микроТГСК [20, 21].

В первое проспективное исследование по сравнению эффективности микроТГСК и стандартной химиотерапии (ХТ) вошло 58 пациентов старше 60 лет с впервые выявленным ОМЛ [22]. Индукционная ХТ включала митоксантрон 8–10 мг/м2 в течении 3 дней и цитарабин 150 мг/м2 в течении 7 дней. Исследуемая группа получала инфузию гапло-идентичных стволовых клеток периферической крови через 36 часов после окончания ХТ. Частота ремиссий была выше в группе микроТГСК как в целом, 80 % против 42,8 % (р = 0.006), так и в подгруппе пациентов старше 70 лет, 92,8 % против 12,5 % (р = 0.0003). Также отмечено более раннее восстановление нейтрофилов, 11 день против 16 дня, и тромбоцитов, 14,5 дней против 20 дней (р = 0.02), а также меньшая частота тяжелых инфекционных осложнений, 26,7 % против

57,5 % (р = 0.03). После достижения ремиссии проводилось еще 2 аналогичных курса консолидации. ОВ в исследуемой группе составила 39,3 % против 10,3 % в контрольной группе (р = 0.01). Микрохимеризм был зарегистрирован у всех пациентов, случаев развития РТПХ не было.

В следующем исследовании те же авторы оценивали эффективность микроТГСК как консолидации ремиссии у пациентов благоприятной и промежуточной прогностических групп ОМЛ [23]. В анализ вошел 101 пациент в возрасте от 9 до 65 лет. Режим кондиционирования состоял из высоких доз цитарабина, через 24ч проводилась инфузия СКПК от га-плоидентичного донора. Шестилетняя общая выживаемость (ОВ) составила 89,5 % в благоприятной прогностической группе и 65,2 % в промежуточной. Содержание C 3 + клеток в трансплантате более 1,1 х 10 8 /кг ассоциировалось с более высокой ОВ, 82,1 % против 55,3 % (р = 0.091).

В качестве возможных механизмов противоопухолевого эффекта обсуждаются как прямое цитотоксическое действие аллоре-активных Т-лимфоцитов и NK -клеток, так и активация C 4+ — клетками донора C 8+ и антиген-презентирующих клеток хозяина.

Другая группа китайских ученых провела сравнение результатов микроТГСК и ал-лоТГСК от HLA-совместимого родственного донора при ОМЛ у пациентов промежуточной и неблагоприятной прогностической группы. Медиана возраста составила 56 (19–65) лет и 53 (45–62) года, соответственно. Режим кондиционирования состоял из высоких доз цитарабина при микроТГСК и циклофосфамида с бусульфаном при родственной HLA-совместимой аллоТГСК. Двухлетняя ОВ после микроТГСК составила 34,5 % против 74,1 % (р = 0.001), частота рецидивов 62,3 % против 17,6 % (р = 0.0001) и ЛНР 4,2 % против 10,9 % (р = 0.251). В исследуемой группе восстановление гемопоэза происходило быстрее и было меньше инфекционных осложнений.

Необходимость использования новых методов для лечения российской популяции пациентов ОМЛ обусловлена значительной долей пациентов с высоким индексом ко-морбидности, более высокой токсичностью при проведении курсов высокодозной ХТ, что требует модификации протоколов, рекомендованных европейскими и американскими руководствами [24]. Реализация совмести- мых родственных аллоТГСК у больных старшего возраста затруднена ввиду малого количества сиблингов в семьях, у возрастных пациентов сиблинги также зачастую имеют значимую сопутствующую патологию, что не позволяет рассматривать их в качестве доноров ГСК. Поиск совместимого неродственного донора не всегда оправдан с учетом длительности и высокого риска рецидива у пожилых больных [25].

Цель . Определение роли микротрансплантация гаплоидентичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови в терапии острого миелоидного лейкоза у пациентов старшей возрастной группы.

Материалы и методы . Микротрансплантация гаплоидентичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови выполнена 33 пациентам в возрасте 55–75 лет (медиана 64 года) с диагнозом ОМЛ (кроме ОМЛ t (15;17), M3 FAB) в первой (n23, 70 %) или второй ремиссии (n10, 30 %). Индукционная химиотерапия проводилась вне клиники НИИ ДОГиТ им. Р. М. Горбачевой и была различной интенсивности: «7 + 3», «5 + 2» или «МДЦ».

В исследование включались пациенты после достижения морфологической ремиссии ОМЛ. При достижении ремиссии пациенты оценивались по индексу коморбидности, проводилось HLA-типирование. Пациентам старше 55 лет, с индексом HCT-C > 3 и отсутствием HLA-совместимого донора аллоТГСК не была рекомендована, они рассматривались как кандидаты на консолидацию ремиссии методом микроТГСК от гаплоидентичного донора. С учетом более молодого возраста в качестве доноров предпочтение отдавалось детям пациентов. Донорами были гаплоидентичные по HLA генам и класса — дети (10 дочерей и 22 сына), у 1 пациента, не имевшего детей, донором был гаплоидентичный брат.

Старше 60 лет был 21 пациент, 12 пациентов в возрасте от 55 до 60 лет. Женщин было 19 (57 %), мужчин — 14 (43 %). Медиана наблюдения составила 21 месяц (4–64 мес).

Согласно молекулярно-генетической классификации ELN2017 к благоприятной прогностической группе относилось 3 (9 %) пациента, к промежуточной — 22 (67 %) и неблагоприятной — 8 (24 %) пациентов (рисунок 1).

ГРУППЫ РИСКА СОГЛАСНО ELN2017

22; 67 %

благоприятный (n3) промежуточный (n22) неблагоприятный (n8)

Рисунок 1. Распределение реципиентов микроТГСК в зависимости от молекулярно-генетической прогностической групп ELN2017

ОМЛ de novo был у 30 (91 %) пациентов, МДС и у 1 пациента ОМЛ, связанный с пред-у 3 (9 %) — вторичный ОМЛ: у 2 пациентов из шествующей терапией (таблица 1).

Характеристика пациентов микроТГСК

Таблица 1.

Пациенты	n33
Возраст	медиана 64 года (55–75)
Пол	Жен — n = 19 (57 %) Mуж — n = 14 (43 %)
Молекулярно-генетическая группа риска ELN2017	Благоприятный — n = 3 (9 %), Промежуточный — n = 22 (67 %) Неблагоприятный — n = 8 (24 %)
Статус заболевания	Ремиссия 1 — n = 23 (70 %) Ремиссия 2 — n = 10 (30 %)

Медиана времени от постановки диагноза до проведения микроТГСК составила 95 дней (59–150). Медиана времени от достижения ремиссии до проведения микроТГСК составила 41 день (14–114).

Консолидация ремиссии проводилась цитарабином в дозе 500–1000 мг/м2 2 раза в дни Д-4, Д-3, Д-2 (суммарная доза 3–6 г/м2). Иммуносупрессивная терапия не проводилась. Затем следовала 36 часовая пауза (Д-1). Инфузия донорских ГСК выполнялась на Д0, премедикация проводилась антипиретиками и антигистаминными препаратами, без глюкокортикостероидов (рисунок 2).

Рисунок 2. Схема микроТГСК

Заготовка ГСК проводилась из периферической крови с помощью аппарата COBE SPECTRA методом лейкоцитафереза. Афере-зу предшествовало назначение для мобилизации ГСК рекомбинантного Г-КСФ в дозе 10 мкг/кг/дн в течение 5 дней. Оптимальная клеточность трансплантата оценивалась по количеству C 3 + клеток на кг массы тела пациента, нижней границей считали 1 х 10 8 / кг. Контроль клеточности осуществлялся методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител анти-C 56+ , анти-C 3+ , анти-C 45+ и анти-C 34+ .

Клеточность трансплантата по содержанию:

• •    CD3 + от 0,5 до 2,5 х 10 8 кг/реципиента (медиана 1,4).

• •    CD34+ от 0,7 до 15,0 х 10 6 кг/реципиента (медиана 3,4).

• •    NK-клетки от 3,6 до 19,0 х 10 8 кг/реципиента (медиана 7,4).

Донорский микрохимеризм определялся методом количественной РВ-ПЦР на основе полиморфизма nsertion/deletion (indel) с чувствительностью 104–105. Микрохимеризм оценивался через 48 часов после инфузии клеток, затем на Д + 8, Д + 15, Д + 21 и далее до исчезновения микрохимеризма.

Результаты. Три микроТГСК проведено 11 (33 %) пациентам, 16 (49 %) пациентам две микротрансплантации и 6 (18 %) пациентам одна. Интервал между микроТГСК составил от 35 до 77 дней (медиана 52 дня). Различия в сроках восстановления гемопоэза в зависимости от порядкового номера микроТГСК были незначительны (таблица 2).

Восстановление кроветворения после микроТГСК

Таблица 2.

	1-я микроТГСК	2-я микроТГСК	3-я микроТГСК
Нейтрофилы > 0,5 х 10 9 /л, дни, медиана (интервал)	13 (4–21)	14 (6–20)	16 (11–19)
Тромбоциты > 20 х 10 9 /л, дни, медиана (интервал)	7 (2–27)	8 (2–18)	7 (4–14)

В благоприятной прогностической группе ELN2017 из 3 пациентов 1 умер в рецидиве, 1 жив в рецидиве, 1 (33 %) жив в ремиссии; в промежуточной группе из 22 пациентов 9 умерло в рецидиве, 13 (59 %) живы в ремис-сии;в неблагоприятной группе из 8 пациентов 2 умерло в рецидиве, 2 живы в рецидиве, 4 (50 %) живы в ремиссии.

В зависимости от количества, проведенных микроТГСК в настоящее время:

• •    после 3-х микроТГСК из 11 пациентов —

• 3 умерло в рецидиве, 1 жив в рецидиве, 7 (64 %) жив в ремиссии;

• • после 2-х микроТГСК из 16 пациентов —

• 7 умерло в рецидиве, 1 жив в рецидиве, 8 (50 %) живы в ремиссии;

• • после одной микроТГСК из 6 пациентов —

• 2 умерло в рецидиве, 1 живы в рецидиве, 3 (50 %) живы в ремиссии.

Влияния уровня C 3 + клеток в трансплантате на результаты микроТГСК в нашем исследовании установлено не было.

Донорский микрохимеризм определялся у 31 (94 %) пациента. Медиана персистенции донорского микрохимеризма составила 8 дней (от 2 до 57 дней) (рисунок 3).

Кинетика донорского микрохимеризма после введения ГаплоГСК

Время, дни                            Время, дни

Рисунок 3. Кинетика донорского микрохимеризма

Летальных исходов, связанных с проведением микроТГСК, не было. Осложнения, возникшие во время проведения микротранс- плантации, можно разделить на 3 группы: иммунные (лихорадка в первые 48 часов после введения ГСК, РТПХ), токсические (кожная сыпь при введении цитарабина), инфекционные (фебрильная нейтропения, энтеропатия, бактериальная пневмония, бактериальный сепсис) и сердечно-сосудистые (ТЭЛА, парок сизм фибрилляции предсердий) (таблица 3).

Осложнения после микроТГСК

	n = 71
Лихорадка в первые 48 часов	66 (92 %)
РТПХ кожи 2 ст .	2(2 %)
Сыпь	14 (19 %)
Фебрильная нейтропения	28 (39 %)
Бактериальная пневмония	6 (9 %)
Сепсис ( E. coli, St. epidirmidis, Kl. pneumoniae )	7 (11 %)
Энтеропатия	2 (2 %)
ТЭЛА мелких ветвей	1 (1 %)
Пароксизм фибрилляции предсердий	1 (1 %)

Таблица 3.

Лихорадка после введения ГСК купировалась введением антипиретиков. РТПХ кожи 2 ст. была подтверждена гистологически у 2 пациентов на 5 и 7 день от введения ГСК и была купирована ГКС в дозе 1 мг/кг в течение 3 и 5 дней.

Для сравнения результатов микроТГСК использовали пациентов двух групп:

1–21 пациент в возрасте 55–67 лет, получивший программную химиотерапию, медиана возраста составила 59 лет. В анализ не включены пациенты, прожившие менее, чем медиана времени от диагноза д о проведения микроТГСК (95 дней).

2–21 пациент в возрасте 55–70 лет, получивший аллоТГСК от HLA-совместимого донора в первой или второй ремиссии, медиана возраста составила 58 лет. Старше 60 лет было 4пациента, от 55 до 60 лет 17 пациентов.

Двухлетняя ОВ после аллоТГСК составила 66 % (95 % ДИ 46–86), 42 % (95 % ДИ 20–64) (медиана 31 мес.) после микроТГСК и 23 % (95 % ДИ 3–43) (медиана 17 мес.) при ХТ (р = 0.05) (рисунок 4).

Рисунок 4. Двухлетняя ОВ у пациентов с ОМЛ в возрасте старше 55 лет в зависимости от метода консолидации ремиссии (ХТ, аллоТГСК, микроТГСК)

Двухлетняя безрецидивная выживаемость после аллоТГСК составила 65 % (95 % ДИ 46–84), 35 % (95 % ДИ 16–54) (медиана 18 мес.) после микроТГСК и 19 % (95 % ДИ 1–38) (медиана 12,4 мес.) при ХТ (р = 0.05) (рисунок 5).

От осложнений аллоТГСК умерло 2 пациента, один в результате инфаркта, второй от инфекционных осложнений на фоне тяжелой РТПХ. Во время проведения ХТ 1 пациент умер от острой сердечно-сосудистой недостаточности, второй от сепсиса.

Рисунок 5. Двухлетняя БРВ ОМЛ в возрасте старше 55 лет в зависимости от метода консолидации ремиссии (ХТ, аллоТГСК, микроТГСК)

Обсуждение . Большинство пациентов с ОМЛ старше 60 лет на момент дебюта заболевания, что ограничивает терапевтические возможности в этой группе [25, 26, 27]. Для пациентов старшей возрастной группы, находящихся в удовлетворительной физической форме и не имеющих значимой сопутствующей патологии может рассматриваться проведение аллоТГСК от HLA-совместимого донора. В анализируемой группе двухлетняя ОВ пациентов в возрасте 55–70 лет после аллоТГСК составила 66 %, безреци-дивная — 65 %. Аналогичные результаты получены и в других исследования, в частности 50 % и 48 % [28], и 66 % и 64 % [29]. Это свидетельствует о возможности проведения аллоТГСК при отсутствии противопоказаний независимо от возраста. Однако значительная доля больных не являются кандидатами для проведения интенсивной ХТ и аллоТГСК. Помимо перспектив использования таргет-ных препаратов, в этой возрастной группе проводятся исследования эффективности риск-адаптированных трансплантаций с транзиторным химеризмом — микроТГСК

[30]. По результатам одного из наиболее крупных исследований uo по эффективности ми-кроТГСК у пациентов с впервые выявленным ОМЛ двухлетняя ОВ в возрастной группе от 60 до 70 лет составила 64–67 % [31]. Основной причиной неудач были рецидивы заболевания — до 40 %, тогда как летальность, не связанная с рецидивом, не превышала 10 %. В нашей работе двухлетняя ОВ составила 42 %, БРВ 35 %, причем все летальные исходы были обусловлены рецидивами ОМЛ.

Заключение . Таким образом, ОВ после аллоТГСК выше, чем после микроТГСК, однако при наличии противопоказаний к проведению аллоТГСК пациентам старшего возраста может рассматриваться микроТГСК в качестве эффективной и безопасной альтернативы ХТ. Для определения оптимальных режимов кондиционирования, изучения влияния клеточного состава трансплантата, длительности микрохимеризма, степени HLA -несовместимости, пола донора на эффективность микротрансплантации требуются дальнейшие исследования.

Конфликты интересов отсутствует

Источник финансирования

Исследование не имело источника финансирования

Вклад авторов

Концепция и дизайн : С. Н. Бондаренко,, Л. С. Зубаровская, И. С. Моисеев, А. Д. Кулагин, Б. В. Афанасьев

Сбор и обработка данных: С. Н. Бондаренко, А. Г. Смирнова, О. Г. Смыкова

Предоставление материалов исследования: Ю. Ю. Власова, Ю. Р. Залялов, О. Г. Смыкова, Л. В. Федорова, А. В. Бейнарович, Н. Ю. Цветков, М. М. Канунников, А. Л. Алянский, И. М. Бархатов, Е. В. Бабенко, Т. Л. Гиндина, Д. Э. Певцов

Анализ и интерпретация: С. Н. Бондаренко, Е. В. Морозова, И. С. Моисеев

Подготовка рукописи: С. Н. Бондаренко, А. Г. Смирнова

Окончательное одобрение рукописи: С. Н. Бондаренко, Б. В. Афанасьев