Модификация метода определения бактерицидной активности крови сельскохозяйственных животных

Защиту животных от заразных болезней наряду с иммунологической реактивностью организма обеспечивают факторы естественной резистентности, в том числе бактериолизины, оказывающие влияние как на грампозитив-ную (лизоцим, бета-лизины), так и на грамнегативную микрофлору (система комплемента). Комплемент в комплексе с нормальными антителами обусловливает бактерицидные свойства крови, которые зависят от условий внешней среды и отражают физиологическое состояние организма. Все методы определения бактерицидной активности крови можно разделить на две группы: чашечные (В.Х. Матусевич) и нефелометрические (О.В. Смирнова, Т.А. Кузьмина). Для определения бактерицидной активности крови нефелометрическим методом требуется относительно большое количество сыворотки (1 мл), а двойная фотометрия может увеличить ошибку измерения (1, 2). Этих недостатков лишен метод О.В. Бухарина с соавт., разработанный для определения бактерицидной активности сыворотки крови человека (3). Однако этот метод оказался малопригодным для определения бактерицидной активности крови жвачных животных, так как точность полученных данных едва достигала 35-40 %, что не позволяет улавливать первые признаки снижения защитных сил организма (4). В связи с этим в ряде случаев не удается достаточно полно оценить степень естественной резистентности животных. Поэтому в задачу нашей работы входила оптимизация параметров общепринятого метода для определения бактерицидных свойств крови сельскохозяйственных животных.

Описание методики . Объектом исследования служили животные, разделенные на группы по принципу аналогов: коровы черно-пестрой породы ( n ₁₁₉

= 45, три группы по 15 гол. в каждой); беспородные кобылы ( n = 15); свиньи крупной белой породы (контроль и опыт соответственно 5 и 10 гол.); овцы романовской породы ( n = 4). Коров I и II групп использовали для оценки влияния объема испытуемой плазмы и концентрации тест-культуры на оптическую плотность опытных образцов и показатели бактерицидной активности крови. У животных III группы определяли бактерицидную активность как общепринятым, так и модифицированным методом. Свиней в опыте (II группа) подвергали комбинированному облучению ультрафиолетовыми и инфракрасными лучами в профилактических дозах в течение 30 сут. Кровь у коров, овец и лошадей отбирали из яремной вены, у свиней — из кончика хвоста утром натощак и для получения плазмы центрифугировали при 3000 об/мин 15 мин. Плазму крови замораживали при температуре –18 ^оС для дальнейшего исследования. Бактерицидную активность крови определяли как общепринятыми, так и модифицированными методами (3).

Сущность модификации метода заключалась в уменьшении объема испытуемой плазмы с 2000 до 20 мкл, а также увеличении концентрации бактерий тест-культуры до 1 млрд микробных тел в 1 мл пробы. Объем постановочной пробы доводили до 200 мкл питательным бульоном. Исследования проводили на фотоэлектроколориметре марки КФК-ХЛ 4.2 с синим светофильтром и кюветой длиной 5 мм. Оптическая плотность тест-культуры составляла 0,500, что соответствовало концентрации 1 млрд микробных тел в 1 мл пробы, а объем питательного бульона уменьшился до 2000 мкл. В реакции использовали эталонный штамм Escherichia coli .

Увеличение времени предварительного инкубирования плазмы крови коров (до добавления питательной среды) с 30 до 60 и 90 мин повысило бактерицидную активность соответственно с 35 до 60 и 75 %. При дальнейшем инкубировании (то есть в течение 120 мин) бактерицидная активность крови снижалась до 60 % (рис.). Следовательно, для определения бактерицидной активности крови инкубирование проб следует проводить в течение 90 мин, что является оптимальным временем. Однако низкая оптическая плотность опытных образцов, соответствующая максимальным показателям бактерицидной активности крови, может привести к искажению результатов исследований. Поэтому в дальнейшем мы провели серию экспериментов, направленных на оптимизацию условий постановки реакции определения бактерицидной активности крови. Так, у коров I и II групп при концентрации бактерий E. coli 500 млн/мл оптическая плотность образцов в контроле после инкубации в течение 180 мин была равна 0,420; оптическая плотность в опыте составляла 0,042±0,002, а бактерицидная активность — 89,7±0,6 %.

Бактерицидная активность крови коров чернопестрой породы в зависимости от времени инкубирования пробы (тест-культура — эталонный штамм

Повышение концентрации бактерий в тест-культуре до 1 млрд/мл повысило оптическую плотность опытных образцов до 0,060±0,003; показатели бактерицидной активности крови в этом случае остались на прежнем уровне — 88,9±1,3 %. При уменьшении объема испытуемой сыво- ротки с 200 до 100 и 50 мкл оптическая плотность опытных образцов составляла соответственно

0,030±0,001;  0,035±0,001  и  0,050±0,002,  бактерицидная активность —

94,7±1,3; 93,5±1,5 и 90,1±1,3 %. Дальнейшее уменьшение объема плазмы до

20 мкл привело к повышению оптической плотности опытных образцов до 0,110±0,012 и снижению бактерицидной активности до 73,7±2,5 %. Уменьшение объема питательного бульона с 5000 до 2000 мкл и использование концентрации бактерий 1 млрд/мл сопровождалось повышением оптической плотности до 0,200±0,05, причем бактерицидная активность снижалась незначительно — 67,9±2,5 %.

Следовательно, в результате модификации метода оптическая плотность образцов в опыте повысилась в 4,5 раза, а бактерицидная активность снизилась в 1,3 раза. При этом расход питательного бульона на одну пробу уменьшился с 5000 до 2000 мкл. У коров III группы (оценка общепринятым методом) бактерицидная активность составляла 90,0±2,5 %, а оптическая плотность — 0,039±0,011. Применение модифицированного метода позволило повысить оптическую плотность до 0,150±0,020, в то время как бактерицидная активность составляла 68,3±4,2, то есть подтвердилась стабильность полученных результатов (табл.).

У овец бактерицидная активность крови составляла 92,5±2,5 %, а оптическая плотность тест-культуры — 0,0015±0,0003. Уменьшение объема плазмы до 100 мкл позволило повысить оптическую плотность образцов до 0,10±0,05, при этом бактерицидная активность уменьшилась до 80,5±4,5 %. При объеме плазмы и питательного бульона соответственно 50 и 2000 мкл бактерицидная активность крови составляла 66,5±5,3 %, а оптическая плотность увеличилась до 0,130±0,06.

Оценка общепринятым и модифицированным методом бактерицидной активно сти крови коров черно-пестрой породы

Бактерицидная активность крови лошадей была выше, чем у жвачных животных — 100 %. При увеличении концентрации бактерий до 1 млрд/мл, а также уменьшении объема плазмы до 100 мкл бактерицидная активность крови лошадей в параллельных пробах снижалась соответственно до 70,8±5,3 и 72,0±6,3 %.

В плазме крови свиней, полученной посредством иссечения кончика хвоста, содержались хлопья фибрина. При использовании общепринятого метода происходила желатинизация реакционной смеси во всех испытуемых пробах. После осаждения хлопьев центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин желатинизация сохранялась. Аналогичные результаты были получены при использовании в реакции 100 мкл центрифугированной плазмы, тогда как при объеме последней 50 мкл не отмечено образования сгустка; при объеме нативной плазмы 50 мкл в отсутствие центрифугирования наблюдалось образование сгустка. Оптическая плотность опытных образцов составляла 0,122±0,015, бактерицидная активность — 51,2±5,9 %. Увеличение кон- центрации бактерий до 1 млрд/мл позволило повысить оптическую плотность образцов на 46 %; бактерицидная активность крови животных в этом случае незначительно снизилась — 47,0±5,8 %. У свиней, подвергшихся воздействию ультрафиолетового и инфракрасного облучения в течение 30 сут, бактерицидная активность крови имела тенденцию к повышению по сравнению с контролем — соответственно 47,8±5,2 и 41,3±2,5 %.

В многократных экспериментах подтвердилась пригодность модифицированных методов для определения бактерицидной активности крови как в норме, так и при различных патологических состояниях сельскохозяйственных животных (4).

Итак, определение бактерицидной активности крови сельскохозяйственных животных необходимо проводить в следующем режиме: 90 мин до и 90 мин после добавления питательной среды. Объем плазмы крови при оценке бактерицидной активности крови у крупного рогатого скота, свиней, мелкого рогатого скота и лошадей должен составлять соответственно 20, 50, 50 и 100 мкл. Плазму крови свиней перед постановкой метода необходимо центрифугировать для осаждения хлопьев фибрина и предупреждения желатинизации реакционной смеси. Для определения бактерицидной активности у животных всех видов объем суспензии тест-культуры (концентрация 1 млрд микробных тел в 1 мл пробы) должен составлять 300 мкл, питательного бульона — 2000 мкл. Модифицированный метод определения бактерицидной активности крови является высокодостоверным, а также адекватно отражает резистентность животных при различных физиологических и патологических состояниях. Кроме того, предложенный метод позволяет использовать фотоэлектроколориметр в оптимальном режиме, рекомендуемом заводом-изготовителем.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    С и д о р о в В.Т, П л я щ е н к о С.И. Естественная резистентность организма сельскохозяйственных животных. Л., 1977.

• 2.    Б а ш м а к о в Г.А. Факторы естественной резистентности и методы их изучения. Военномедицинский журн., 1982, 6: 38-40.

• 3.    Б у х а р и н О.В., С о з ы к и н В.Л. Фотонефелометрический метод определения бактерицидной активности крови. В сб.: Факторы естественного иммунитета /Под ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979: 43-45.

• 4.    С а р у х а н о в В.Я., И с а м о в Н.Н. Бактерицидные свойства крови различных видов сельскохозяйственных животных под влиянием голодания и облучения. С.-х. биол., 2001, 2: 80-83.

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии , 249030, Калужская обл., г. Обнинск, Киевское шоссе, 109 км