Молекулярно-генетическая характеристика инбредных линий подсолнечника по изоферментным маркерам и ДНК-профилям

Автор: Гучетль С.З., Челюстникова Т.А., Рамазанова С.А., Антонова Т.С.

Журнал: Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур @vniimk

Статья в выпуске: 2 (131), 2004 года.

Бесплатный доступ

Паспортизировано 32 инбредные линии подсолнечника по 8 изоферментным системам. Уникальность коллекции составила 75 %. Показано, что использование 14 праймеров для ПЦР выявило 79 фракций ДНК, из которых 25 (31.65 %) были полиморфными. Установлено, что выявленные полиморфные продукты амплификации наследуются по доминантному типу.

Короткий адрес: https://sciup.org/142150692

IDR: 142150692

Текст научной статьи Молекулярно-генетическая характеристика инбредных линий подсолнечника по изоферментным маркерам и ДНК-профилям

Увеличение разнообразия родительских линий и гибридов подсолнечника влечет за собой проблему их идент ификации для защиты прав селекционеров.

Но пой причине для описания и точной дифференцировки новых форм подсолнечника используются, наряду с традиционными морфологическими признаками (принятыми UPOV), и молекулярно-генетические маркеры (официально пока не утвержденные).

Наиболее изученными и удобными в применении являются изоферментные маркеры, гак как они имеют' кодоминантное наследование; стабильно экспрессируются, независимо от условий окружающей среды; в большинстве своем наследую гея несцеп-ленно друг с другом, и, следовательно, маркируют разные группы сцепления. Отечественными и зарубежными исследователями было изучено и использовано для паспортизации линий и гибридов подсолнечника наследование порядка 15 изофермент-пых систем подсолнечника 11,2, 3|.

(' целью увеличения количества молекулярных маркеров используется и полиморфизм фракций ДНК, амплифицированной методом полимеразной цепной реакции. Методы ПЦР используются для идентификации сортов и видов культурных растений [4, 5]. Для паспортизации коллекции инбредных линий ВНИИМК нами были использованы оба ін на вышеперечисленных молекулярных маркеров.

Методики. В работе были использованы 32 инбредные линии отдела селекции гибридного подсолнечника ВНИИМК. Изоферменты экстрагировали гомогенизацией части семядоли сухой семянки в 20 мкл 0J М трис-НС буфера с добавлением 0,1% ноли винил пирролидона. Электрофорез выполняли в 12 %-ном крахмальном геле с добавлением 2,04 % сахарозы. Для электрофоретического разделения изоферментов использовали 3 буферные системы, составленные по методикам, предложенным Cardy et al. [6]. После электрофореза гелевая пластина разрезалась тонкой нихромовой нитью на 5-6 срезов. Выявление зон энзиматической активности проводилось окрашиванием по стандартным прописям Vallejos ]7|.

Дая проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) геномную ДНК выделяли из семядольных листьев 5-7-дневных этиолированных проростков с помощью модифицированного метода Saghai-Maroof et al. [8] с использованием СТАВ буфера.

ДНК была амплифицирована в амплификаторе «Тсрцик» (АС) ДНК-технология, Россия). Продукты амплификации разделяли электрофоретически в 2 %-ном агарозном геле с 1 АЕ буфером, с добавлением бромистого эт идия. Подбор праймеров, длиной от Ю до 23 нар нуклеотидов осуществляли по литературным данным [19].

Рсультшпы и обсуждение. Детальный анализ наследования изоферментных систем был выполнен нами ранее |1, 2] и результаты исследований представлены в табл. 1. Изученные изоферментные системы имеют в основном но несколько зон актив- пости. Полиморфные зоны контролируются генами с 2-3 кодоминантными аллелями (табл. ]).

Таблица 1. Аллельные варианты, контролирующие наследование зон активности изоферментных систем

Ферментная	Зона	Локус	--------------------------— 1 Аллельный
сие гема	акгивнести		вариант
Эстераза	ESI 1	Est 1	S, F, vF _______________________ .
Малатдсі идрогеназа	MDH 1	Mdh 1
	MDH 2	Mdh 2	S, Г
		Mdh3	-
	MDH 3	Mdh4	S, F. vF
	МОП 4	! Mdh 5	І s. у
6 фосфог. покоса глегидрогеназа	PGD 1	. Pud J	i S. I '
	І PGD2	' Pyd 2
	ІЧЮ 3	Ped 3	-
Глутамат дсі идрогеназа	GDH 1	(kill I 1	S, F
Фосфоглюкомут аза ,	PGM 1	Pgm 1
	PGM 2	Pgm 2	-
	PGM3 j	Pam 3 ;	-
	PGM 4	Pgm 4	S.K
Кислая фосфата ы	АСР 1	Аср 1	S. 1
і люко.юфоефаідеі идрогеназа	GPI 1	Gpi 1	S. 1
И юниграгтегидро! сназа	11)11 1	Idh 1	S. 1
	11)11 2	Idh 2

Следующие наиболее полиморфные и стабильно экспрессирующиеся ферментные системы были использованы нами для характеристики линий: ES Г I, MDH 2, 6PGD 1, GPI 1. PGM 4, АСР 1, ЮН 1. Линию считали однородной, если все анализированные семянки имели идентичный генотип. По всем инбредным линиям были составлены нзофермснтные паспорта. Анализ биохимических характеристик 32 линий показал, что они группируются в 24 группы, отличающиеся друг от друга (табл. 2). Каким образом, в одну группу попадало несколько линий, имеющих сходный генотип по изофер-менгно.му составу. Процен т уникальнос ти анализированной коллекции составил 75.

Теоретически, использование 8 изоферментных локусов с 2-3 аллелями позволяет идентифицировать предсгавленную коллекцию. Однако некоторые типы аллозимов являются достаточно редкими. Например, у всех анализированных образцов аллельный варнак 1 Ғ локуса Idh 1 нам не встретился ни разу. У кислой фосфатазы были только ал-лозимы АСР 1-S и АСР l-Ғ. Аллельный вариант Acpl-F можно считать уникальным, поскольку он был обнаружен лишь у образца ВК 571 (частота аллеля 0,03). Генотип остальных образцов по этому признаку - Acpl-S/ Аср 1-S. У фосфоглюкомутазы аллельный вариант Pgm 4-F встречался с частотой 0,09. Редкий аллельный вариант у эстеразы -Est 1-vF (0,09). Est GF и Est 1-S встречались с одинаковой частотой (0,44). По остальным четырем изоферментным локусам частота аллельных вариантов распределилась следую- щим образом: Gdh 1-S - 0,66: Gdhb F - 0,34; Mdh 2-S - 0,75, Mdh 2-F 0,25; Gpil-F -0,72, Gpil-S 0,28;6P^dl-S 0,59, 6I\dbF - 0,41.

Тиилиңи 2. Июфсрліенпшые фенотипы 32 ннбредных линий подсолнечника

Линии	И³⁰ферме!иные фено типы
Линии	FST	MD H	GP1 '	PGI)	GDH	AGP	-PGM_	11)H
ВЬ 4303 В	FF	_ss			__L’F _	ss	ss	ss
ВК 700-1	ГТ	Fl_	FF _	it_		_ss_	__SS-	ss
К 1721 В	\FvF	IT_		" '_ss_	_ss_	_ss_	__SS-	_ss__
34-36	IT	-SS_	L ^lqCZ	_IT i	sy_	ss	ss	_ss_
Л 2791	SS	_ss	"f f	SS	ss	ss	_ss___	_E1_
ВК 678	SS	ss	JT	ss		ss	FF	ss
ВК 539	IT	ss_	_ Eli	ss	__ ss	__SS-	ss	ss
ВК 530	v FvF	_jt_	_ ss.		JJL	_ss	_ss	_ss_
‘ ВК 392 if	vl V 1 ’*			~SS...... .	___ss__	_SS__	ss	ss
57КМ 106 ”		ss	_ss	ss_	ss	„_ss	s s	_11_
В К 654	SS	Id- _	"ss ‘	" ss	FF	_ SS_	ss	ss
і ВК 653 В	ss" ‘	^PP		ss	■ ss	_ss_	ss	_^sl_
\| ВК 276		IT J		~SS 22		ss	—Il	ss
\|ЛД796, JI 2769.........	DY '	ss	i 1 F_					ss
/л 28(Ю " ' Г В К 580-L 57 1 ВК 580, ВК 5-11	I__І 1		_FF	FF__	ss _	'__ss_	ss	ss
/л 28(Ю " ' Г В К 580-L 57 1 ВК 580, ВК 5-11	n	" SS.....	ff"	"ff	ss	ss	ss	ss
404 А	SS '	_ 1L_.	_ss__	" ss	__ss__	ss	IT	ss
ВК 389 Ь	_ss_	_ss	" IT	s s	SS	ss		ss
ВК 57?	IT _	F F	^ss"	' EU	_FF_	FF	I ss	ss
Л 27бГ	JsS "	_ ss	“ff _	Z‘ss2"	""-SS__	__s_s_	Г ss	ss
"ІІА 385 А	Jss_	„ I^s	; ^PF	......ss	ss	ss	ss	ss
ВК499 Ь/ВК700'	_ss	s_s	]t_	L ^Fp _	ss	_'ss	__ss_	ss
.....Л 2798.................	_ss "	ss"	' ^pp	" Jff.....		_Jss ’	"s s	ss
ВИР 471. НА 385 К В К : 461	" ss"""	"ss	......FF	ss	FF	ss	ss 1_________	ss

Мы полагаем, что такая различная частота встречаемости аллелей у селекционных линий подсолнечника может свидетельствовать об их неодинаковой ценности для практической с cj і е к ц и и.

Невозможность достижения 100 %-ной отличимости коллекций инбредных линий лишь но изоферментным маркерам характерна для разных культур, в том числе и подсолнечника, поскольку родительские линии гетерозисных гибридов зачастую происходя! из небольшого числа источников.

It связи с необходимостью увеличения количества маркеров для идентификации образцов, у К) линий подсолнечника был изучен полиморфизм фракций ДНК, выявляемый полимеразной цепной реакцией с 14 праймерами (РТС), Р-46, Р-28, PawS 5-6, XLRR.YTL, Cat, Y 1l,L 14, PawS 16-17, Р-38, Р-53, MDGN, NLRR) (табл. 3).

Как видно из табл. 3, использование некоторых праймеров в ПЦР не давало спектров амплифицированной ДНК (Р-38, Р-53, MDGN, NLRR). ПЦР с праймерами L14 и (’at производили ампликоны, но в пределах изученной коллекции линий полиморфизм по ним обнаружен не был. Восемь остальных спектров амплифицированной ДНК включали 7-1 I фрагментов на праймер (в среднем 7,9 фракций, генерируемых при использовании одного праймера). Среднее число полиморфных фрагментов на праймер составляет 3,13.

Таблица 3. Полиморфизм фрагментов ДНК подсолнечника, выявляемый 14-ю праймерами

Название праймера	Число учитываемых фрагментов ДНК	Число полиморфных фрагментов ДНК	Название праймера	Число учитываемых фрагментов ДНК	Число полиморфных фрагментов ДНК
РТО	И	7	L 14	1	0
Р-46	8	3	PawS 16 J 7	9	3
Р-28	7	3	Р38	0	0
PawS 5.6	9	3	Р-53	0	0
XL RR	11	2	MDGH	0	0
YTL	9	2	NLRR	0	0
Cat	7	0	И того	79	25
Y 11	7	2

Таким образом, использованные 14 праймеров для ПЦР, показали на фореграм-мах 79 фракций, из которых 25 (31,65 %) были полиморфными. Линии маркировались наличием-отсутствием фракций. Скрещивание линий с контрастными генотипами показало, что полиморфные продукты амплификации ДНК являются менделевскими признаками и наследуются по доминантному типу. Использование 4 праймеров (Р46, Р28, РТО, XLRR), выявляющих наибольший полиморфизм фракций амплифицированной ДНК, позволило идентифицировать 9 инбредных линий подсолнечника (ВК 591, ВК 276, ВК 539, ВК 464, ВК 571, ВК 678, ВК 639, ВК 653, ВК 541) (табл.4).

Таблица 4. Характеристика линий подсолнечника по 12 полиморфным продуктам ПЦР

Праймер и количество нар нуклеотидов фракции	Линии подсолнечника
Праймер и количество нар нуклеотидов фракции	ВК 591	НК 276	ВК 539	ВК 571	ВК 639	ВК 653	ВК 678	ВК 464	ВК 541
XLRR #740	1	0		0	0	0	0	0	0
XLRR #450	1	1	1	1	1	0	I	0	I
Р46 #750	0	()	0	0		0	0	0	0
Р28 #950	0		0			]		I
РГО# 1400	1	1	1	1	0		0	I	I
РТО #900	1	1	1	1	0	0 ¹	0	I	0 о"
РТО#750	1	0	1		0	0	0	0	0 о"
РТО #740	0	1	0	0	1	I	0	0	]
Р ГО #600	0	0	0	0	1		]	I	0
РТО#550	1		1	1	0	0	0	0	I
РТО #400	1	0	1	1	0	I	0	I	0
РТО #380	0		0	1д>_	0	0 __	_0	__

Примечание: 1 - наличие фракции в указанной позиции, 0 - отсутствие фракции.

Выводы. Использование 8 изоферментных систем позволило сгруппировать 32 инбредные линии подсолнечника в 24 отличающиеся группы. Выявлены редкие аллельные варианты.

Восемь праймеров для ПЦР из 14 использованных выявляют полиморфизм фракций амплифицированной ДНК, пригодный для молекулярно-генетической характеристики инбредных линий подсолнечника.

Статья научная