Молекулярно-генетические маркеры радиочувствительности, позволяющие прогнозировать появление радиационных повреждений у больных, проходящих лучевую терапию

В настоящее время радиотерапия является одним из основных способов лечения онкологических больных. Применение лучевой терапии приводит к хорошим результатам при лечении опухолей головы, шеи, шейки матки, мочевого пузыря и других локализаций. В некоторых случаях, в результате лучевой терапии могут возникать лучевые реакции и повреждения здоровых органов и тканей [1]. Данные реакции могут быть ранними, возникающими в течение первых трех месяцев лечения и влияющими на его ход, а также поздними, которые могут возникать в течение нескольких лет после лечения и оказывать влияние на качество жизни пациентов [4].

В целом, умеренные лучевые реакции – частое явление для пациентов, проходящих лучевую терапию. Однако в некоторых случаях наблюдаются более выраженные повреждения, которые могут представлять серьезную угрозу для пациента [5]. Развитие таких радиационных повреждений определяется многими факторами: дозой облучения, мощностью дозы, объемом облучаемого участка, типом источника облучения, использованием химиотерапии, наличием сопутствующих заболеваний, возрастом пациента. Однако при идентичных клинических условиях, при использовании стандартных радиотерапевтических протоколов, у больных могут наблюдаться заметные различия в характере и степени выраженности лучевых реакций [22]. Выявление радиочувствительных пациентов, у которых высока вероятность развития выраженных повреждений (на основании соответствующих предиктивных маркеров) еще до начала лечения, с целью коррекции их радиотерапевтических протоколов, а именно выбора оптимальной толерантной дозы, позволяющей получить локальный контроль над опухолью и снизить риск повреждений, является важной клинической задачей. Соответственно, исследования, направленные на поиск маркеров, с помощью которых станет возможным предсказывать появление радиационных повреждений, имеют большое значение [14].

Молекулярно-генетические аспекты патогенеза радиационных повреждений

На сегодняшний день все большая роль в развитии лучевых реакций и повреждений отводится наследственным факторам. Например, в ранних исследованиях, у пациентов с синдромами, характеризующимися повышенной радиочувствительностью, такими как атаксия телеангиэктазия, синдром повреждения Неймегена и LIG4-синдром, обнаружены мутации в генах репарации ATM, NBN, LIG4, соответственно [11]. Однако стоит отметить, что данные мутации, приводящие к серьезным нарушениям функций соответствующих белков - замены нуклеотидов, приводящие к образованию стоп-кодона (нонсенс-мутации) или инсерции/делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, встречаются очень редко (менее 1%) и в большинстве случаев не объясняют различий в радиочувствительности среди пациентов [19]. Поэтому большее значение, по сравнению с редкими мутациями, отводится более частым генетическим изменениям, например однонуклеотидным заменам – SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Частота их встречаемости в популяции превышает 5%. В кодирующих регионах гена они приводят к аминокислотным заменам в белке, в регуляторных регионах гена - к изменению регуляции экспрессии гена, а в сайтах сплайсинга – к нарушению сплайсинга. SNP относятся к менее пенетратным, т.е. менее патогенным изменениям, однако суммарно (за счет нескольких десятков и сотен таких полиморфизмов) могут определять радиочувствительность пациентов [9,12].

Для поиска данных генетических маркеров радиочувствительности, в первую очередь, необходимо иметь представление о том, какие молекулярные механизмы в клетке активируются в ответ на действие ионизирующего излучения. Основным компонентом в клетке, на который воздействует радиация, является ДНК. Такое воздействие может иметь либо прямой повреждающий характер за счет ионизации связей в молекуле ДНК, либо косвенный за счет образования свободных радикалов – молекул и атомов с неспаренными электронами. В результате такого прямого или косвенного действия в ДНК образуются одно- и двунитевые разрывы [29]. Однонитевых разрывов образуется больше, чем двунитевых, которые при этом репарируются тяжелее. Именно двунитевым разрывам отводится основная роль в повреждении ДНК. Двунитевые разрывы распознаются MRN – комплексом, в состав которого входят белки MRE11, NBS, RAD50, что в дальнейшем способствует активации серин-треониновой киназы ATM [13]. ATM посредством фосфорилирования активирует эффекторную киназу CHEK2, которая в свою очередь активирует ингибиторы циклин зависимых киназ CDKN1A и CDKN1B, что в итоге приводит к остановке клеточного цикла. Остановка клеточного цикла в данном случае необходима для осуществления процесса репарации. Репарация может осуществляться двумя путями: в случае остановки клеточного цикла в точке G2-M, репарация идет по пути гомологичной рекомбинации с участием белков RAD52, RAD51, RAD54, XRCC2,

XRCC3, а в случае остановки клеточного цикла в точке G1-S, репарация проходит посредством не гомологичного соединения концов c участием таких факторов, как PRKDC, XRCC6, XRCC5, LIG4, XRCC4, DCLRE1C [20]. Также стоит отметить, что доступ участников репарации к поврежденной ДНК “облегчается” благодаря фосфорилированию гистона H2AX, которое также происходит при помощи киназы ATM [24].

При дефектах системы репарации, а также при серьезных повреждениях ДНК, ATM фосфорилирует белок p53, который будучи фактором транскрипции, активирует гены (GADD45, APAF1, BAX), белковые продукты которых принимают непосредственное участие в индукции клеточной смерти посредством апоптоза. Такой радиационно-индуцированный апоптоз, например, происходит в стволовых клетках базального слоя многослойного эпителия кожи, полости рта, пищевода [23, 14]. Данные стволовые клетки, во-первых, способны воспроизводить сами себя, являясь быстро пролифилирующими, и, как следствие, более радиочувствительными. Во-вторых, они способны дифференцироваться в зрелые клетки, т.е. являются основным источником пополнения эпителия новыми клетками. В связи с этим их повышенная гибель может привести к нехватке клеток поверхностных слоев эпителия, нарушению эпителиального барьера и, как результат, развитию таких распространенных реакций кожи, как эритема, дерматиты, язвы, а также развитие мукозитов полости рта различной степени тяжести. Радиационно-индуцированный апоптоз в гемопоэтических стволовых клетках может быть также причиной таких реакций крови как лейкопения и анемия [28].

Помимо этого, образование свободных радикалов стимулирует выработку хемокинов, ростовых факторов и провоспалительных цитокинов, что также способствует развитию лучевых реакций воспалительного характера. Для поздних лучевых реакций характерны такие процессы как фиброз, атрофия и сосудистые изменения, при которых также важную роль играют цитокины, факторы роста и хемокины, такие как IL2, IL8, TGFb, EGF, FGF, TNF [29].

Таким образом, развитие лучевых реакций на молекулярно-клеточном уровне может быть следствием нарушения работы множества механизмов (регуляции клеточного цикла, репарации ДНК, апоптоза, антиоксидантной защиты, воспаления и др.), а индивидуальная радиочувствительность пациентов, вероятнее всего, определяется изменчивостью одновременно большого количества генов.

Поиск наследственных маркеров радиочувствительности. Радиогеномика

За последние 10 лет опубликовано более 60 публикаций, посвященных идентификации генетических маркеров радиочувствительности [2]. Основной подход, используемый в ранних работах, связан с анализом ассоциаций, т.е. исследованием двух групп сравнения по определенным генетическим маркерам (в основном SNP). Сравнивают контрольные группы и группы пациентов с интересующем фенотипом (в данном случае это группы пациентов с умеренными лучевыми реакциями и группы пациентов с выраженными лучевыми повреждениями соответственно) и затем оценивают различия в распределении частот аллелей между этими группами. Основным параметром, характеризующим различия, является “отношение шансов” - OR (англ. Odds Ratio). Отношение шансов – это отношение двух значений: шанса того, что индивид, имеющий данный аллель проявляет данный признак, к шансу того, что индивид проявляющий признак, не имеет исследуемого аллеля. Аллель ассоциируется с данным признаком, если частота этого аллеля гораздо выше в исследуемой выборке, чем в контрольной группе, и тогда отношение шансов будет больше 1. С помощью критерия χ² рассчитывается P- значение, характеризующее значимость отношения шансов [6].

В ряде исследований выявлены ассоциации отдельных SNP в генах, белковые продукты которых участвуют в процессах репарации, с развитием радиационных повреждений [7, 8, 18]. Однако полученные результаты считаются спорными, так как по многим из них не проводились повторные, подтверждающие исследования в других исследуемых группах и популяциях, а также объемы некоторых исследуемых выборок были небольшими и поэтому не удовлетворяли в полной мере требованиям к сравнительным генетическим исследованиям.

Новые технологии генетического анализа, такие как ДНК-микрочипы и секвенирование нового поколения (NGS), позволяющие анализировать одновременно большое количество SNP в большом количестве генов, изменили формат анализа ассоциаций, превратив его в полногеномный (GWAS – genome-wide association studies). Учитывая, что патогенез лучевых реакций это сложный многофакторный процесс – результат изменчивости множества генов, использование такого подхода для поиска маркеров радиочувствительности становится вполне оправданным и рождает новое исследовательское направление именуемое “радиогеномикой” [21].

С целью повышения точности и достоверности результатов, в радиогеномике полногеномный анализ ассоциаций принято проводить в два этапа. На первом этапе исследуемая когорта случайным образом разбивается на две группы и с помощью готового коммерческого набора (ДНК-микрочип и NGS - панель) проводится анализ ассоциаций и сравнение первой группы пациентов с контрольной. Далее по SNP, которые показали четкие различия в частотах аллелей в первой группе по сравнению с контрольной, проводятся такие же сравнения, но уже второй группы и той же контрольной группы. Ассоциированными считаются те SNP, которые демонстрировали одинаковые частоты аллелей в обеих группах, и при этом наблюдались четкие и достоверные различия в частотах аллелей между исследуемой и контрольной группами [16].

Развитие радиогеномики, как нового направления, требует совместного участия многих исследовательских коллективов из разных научных центров. Это облегчит создание более качественных и больших по численности исследуемых когорт для GWAS исследований. Также появится возможность (как уже отмечалось выше) проводить подтверждающие исследования SNP на других популяциях. В 2009 году несколькими ведущими исследовательскими группами был создан “Международный радиогеномный консорциум”, задача которого способствовать сотрудничеству и объединению усилий исследователей разных лабораторий и исследовательских центров, с целью повышения качества полученных результатов [26, 27].

Первыми результатами таких объединенных GWAS исследований было выявление выраженной ассоциации SNP rs2268363 (OR = 7, P = 5.4 * 10 -8 ) в гене FSHR с побочной реакцией от лучевой терапии в виде эректильной дисфункции у афроамериканских пациентов с раком простаты. Ген FSHR кодирует рецептор фоликулостимулирующего гормона, нарушение сигнального пути которого может приводить к нарушению сперматогенеза и бесплодию [15].

В результате трехстадийного GWAS исследования испанской, британской и североамериканской когорт пациентов с раком простаты было обнаружено, что SNP rs104972703 в гене TANC1 имеет четкую ассоциацию (OR = 6.6, P = 4.6 * 10^-11) с лучевыми реакциями общего характера. Белковый продукт гена TANC1 участвует в образовании миобластов при формировании миотубов, т.е. важен для регенерации мышечных волокон [10].

При исследовании когорты, насчитывающей около 800 пациентов с раком простаты, лучевые реакции в виде ректальных кровотечений были ассоциированы с SNP-полиморфизмами rs7120482 (OR=3.1, P=4.6 * 10-11) и rs17630638 (OR = 2.9, P = 6.9 * 10-7) в регуляторном регионе гена SLC36A4 [17]. Белковый продукт гена SLC36A4 – переносчик аминокислот влияет на активность mTOR-сигнального пути, основная функция которого – регуляция роста и пролиферации клеток. В другом аналогичном исследовании была обнаружена строгая ассоциация полиморфизма rs2788612 (OR = 9.9, P = 1.1 × 10-11) гена KCND3 с такой поздней реакцией, как ректальное недержание у пациентов с раком простаты. Ген KCND3 кодирует белок - ионный канал, который обильно экспрессируется в клетках гладкой мускулатуры прямого кишечника [3].

Естественно, что большие усилия радиогеномных исследователей направлены на поиск генетических вариантов, ассоциированных с развитием лучевых реакций, возникающих при радиотерапии больных раком молочной железы. Одним из таких исследований был анализ ассоциаций на когорте, состоящей из 2000 пациенток, у которых наблюдались поздние реакции, такие как фиброз и телеангиэктазия. В результате выявлены ассоциации с полиморфизмами в гене TNFa [25]. В другом подобном исследовании обнаружены ассоциации (OR = 3.2, P = 0.012) полиморфизма rs1139793 в гене TXNRD2 с подкожными фиброзами. Ген TXNRD2 кодирует фермент тиоредоксин редуктазу-2, который играет важную роль в защите клеток от оксидативных стрессов [29].

Таким образом, развитие лучевых реакций и повреждений может быть ассоциировано не только с изменениями в генах, белковые продукты которых активируются в ответ на действие ионизирующего излучения или других агентов (гены репарации, апоптоза, антиоксидантной защиты и пр.), а также в генах, белковые продукты которых постоянно выполняют свои функции в клетке, находящейся в нормальном состоянии. Представленные результаты лишний раз указывает на сложность патогенеза побочных лучевых проявлений и оправдывает целесообразность использования высокопроизводительных полногеномных методов исследования.

Стоит отметить, что при формировании выборок, исследователям приходится преодолевать некоторые проблемы, которые могут затруднить поиск ассоциаций. Во-первых, важно четко различать лучевые реакции и симптомы осложнений сопутствующих заболеваний. Например, у пациентов с раком простаты симптомы нижних мочевых путей и эректильная дисфункция могут быть как побочным эффектом химиолучевого лечения, так и сопутствующими осложнениями данного заболевания. В связи с этим, важно исключать из сравнительного исследования пациентов, у которых были выявлены данные симптомы еще до начала лечения.

Другой важной проблемой радиогеномных исследований является присутствие в исследуемых выборках пациентов, у которых различия в характере и степени выраженности лучевых реакций обусловлены различиями в химиотерапевтических протоколах, используемых для их лечения. Такие показатели как доза, мощность дозы, объем облучаемого участка, тип источника излучения, тип модификаторов являются очень важными и от них непосредственно зависит степень лучевых реакций. Поэтому необходимо, чтобы пациенты, привлеченные к радиогеномным исследованиям, находились в одинаковых клинических условиях и получали максимально идентичное химиолучевое лечение. Определенные затруднения в выявлении ассоциированных полиморфизмов возникают также в связи с тем, что разные исследовательские учреждения используют различные способы оценки токсичности одних и тех же реакций. Кроме того, не всегда удается проводить долгосрочное наблюдение пациентов (как исследуемой группы, так и контрольной группы), что необходимо для поиска молекулярных маркеров - предикторов поздних реакций, которые могут возникать спустя несколько месяцев и даже несколько лет после лечения [14].

Заключение

Радиогеномика на сегодняшний день является актуальным и перспективным направлением, так как использование в клинической практике новых генетических маркеров, прогнозирующих развитие радиационных повреждений, позволит значительно повысить эффективность персонифицированного химиолучевого лечения. Однако, многие аспекты, касающиеся патогенеза различных лучевых реакций и повреждений, еще требуют более детального изучения. Для этого необходимо участие еще большего количества исследовательских коллективов со всего мира и привлечение самых современных и высокопроизводительных методов генетического анализа.