Молекулярно-генетический анализ факторов наследственной тромбофилии при гестозе

Введение

Проблема профилактики осложненного течения беременности занимает одно из ведущих мест в современ- ном акушерстве. Одним из наиболее тяжелых и распространенных видов акушерской патологии является гестоз, встречающийся у 6–20% беременных. Несмотря на мно- гочисленные исследования патогенетических механизмов развития заболевания и появление новых методов лечения гестоза, он продолжает занимать ведущее место среди причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности [1]. На долю гестоза приходится до 70% мертворождений и выкидышей, а величина перинатальных потерь при гестозе возрастает почти в 5 раз [2]. Высокая частота гестоза и характер его осложнений для матери и плода диктуют необходимость поиска новых методов профилактики и лечения заболевания. В настоящее время существует множество теорий развития гес-тоза (неврогенная, гормональная, почечная, плацентарная, иммунологическая, генетическая), но ни одна из них не может полностью ответить на все вопросы его генеза. Исследования последних лет показали, что ведущую роль в патогенезе гестоза играют сосудистые расстройства: ангиоспазм, нарушение состояния и проницаемости сосудистой стенки, изменение реологических свойств крови и микроциркуляции. Исходя из современных представлений о патогенезе гестоза, в качестве возможных генетических маркеров данной патологии можно выделить полиморфные варианты генов, ответственных за развитие эндотелиальной дисфункции и гиперкоагуляции.

Цель исследования: выявление роли факторов наследственной тромбофилии в развитии гестоза в популяции русских.

Материал и методы

В рамках данной работы обследованы 140 русских женщин с беременностью, осложненной гестозом. В работе применяли отечественную классификацию гестоза: водянка беременной, нефропатия (легкой, средней, тяжелой степени тяжести), преэклампсия, эклампсия. Оценку степени тяжести гестоза проводили по балльной шкале Goecke в модификации Г.М. Савельевой [3]. Контрольную группу (150 человек русской национальности) составили недавно родившие женщины с физиологически протекавшей беременностью. Были изучены частоты следующих маркеров наследственной тромбофилии: аллельные варианты С677Т и A1298C гена метилентетра-гидрофолатредуктазы (MTHFR), маркер G20210A гена протромбина (FII), полиморфизм G1691A гена пятого фактора свертывающей системы крови (FV), мутация – 675 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена (PA1-1).

У обследованных индивидуумов была выделена ДНК, проамплифицированы интересующие полиморфные локусы (методом ПЦР) с последующим рестрикционным анализом с помощью специфических эндонуклеаз. Продукты амплификации и рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном и 8%-ном полиакриламидном гелях соответственно, окрашивая бромистым этидием.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета статистических программ “Statistica 7.0”. Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий Колмогорова–Смирнова. При проведении попарного сравнения частот аллелей, генотипов и гаплотипов между анализиру- емыми группами использовали критерий χ2 с поправкой Йейтса. В исследуемых группах для SNPs вычисляли отношение шансов (OR) и доверительные интервалы (CI) для отношения шансов (95% CI). Соответствие распределения частот аллелей и генотипов равновесию Харди– Вайнберга проверяли по критерию χ2. Различие двух сравниваемых величин считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

По всем исследованным локусам частоты аллелей и генотипов находились в диапазоне мировых, а распределение частот генотипов соответствовало равновесию Харди–Вайнберга. При сравнительном анализе изученных полиморфизмов было выявлено достоверное повышение частоты генотипа 677ТТ локуса MTHFR в группе женщин с гестозом (15%) по сравнению с контрольной группой – 2% ( χ ²=16,66; р<0,05). При попарном сравнении частоты аллелей по локусу С677Т гена MTHFR значимо отличались в группе беременных с гестозом и контрольной группе ( χ ²=13,89, р<0,05). Необходимо подчеркнуть, что согласно полученным данным, носительство аллеля 677Т гена МTHFR увеличивает риск гестоза в 2 раза, а генотипа 677ТТ – в 8 раз (OR=8,17, CI 2,37-28,17 и OR=2,05, CI 1,40-3,01 соответственно). Второй изученный маркер гена MTHFR – А1298С также показал статистически значимую ассоциацию с гестозом (при сравнении частот генотипов χ ²=7,14, р<0,05): генотип 1298СС в группе больных гестозом встречался в 2 раза чаще (21%), чем в контрольной группе (10%). При анализе частот генотипов полиморфного варианта –675 4G/5G гена PA1-1 в группе беременных с гестозом генотип 4G/4G встречался в 1,7 раз (48%) чаще, чем в контроле (28%) ( χ ²=12,24, р<0,05; OR=2,36, CI 1,45-3,84). Сравнение частот аллеля 4G в исследуемых группах также выявило достоверно более высокие значения частоты данного аллеля в группе с гестозом ( χ ²=11,23, р<0,05; OR=1,77, CI 1,27-2,47). При сравнительном анализе частот генотипов и аллелей по полиморфизмам G1691A гена FV и G20210A гена FII значимых отличий не найдено.

По результатам нашего исследования гестоз достоверно ассоциировал с мутацией 677Т, которая представляет интерес в связи с патологическими состояниями, ведущими к накоплению гомоцистеина в организме и повреждению эндотелия сосудов. Ряд исследований показали, что носительство аллелей 677T и 1298С предрасполагает к развитию умеренной гипергомоцистеинемии и повышению риска развития многих распространенных заболеваний, особенно на фоне снижения фолатного статуса [4]. Результаты современных работ по выявлению ассоциации полиморфизмов С677Т и А1298С гена MTHFR с нарушением физиологического течения беременности весьма противоречивы. Обнаружено, что в два раза чаще мутация С677Т присутствует в группе женщин с гесто-зом, при этом гомозиготная форма ТТ встречается в 4 раза чаще, чем в контроле. Имеется выраженная тенденция к прямой зависимости частоты встречаемости маркера С677Т от тяжести гестоза [5]. Наиболее часто он встречается при тяжелых формах гестоза (77,8%) и по- вторном гестозе (86,7%). У женщин с генотипом 677ТТ гена MTHFR достоверно повышен риск развития гестоза тяжелой степени при последующих беременностях (53,8%) [6]. Тем не менее, исследования, проведенные в шотландской, чешской, бразильской и чилийской популяциях, не выявили ассоциации аллеля Т с преэклампсией (ПЭ) [7, 11, 13, 14]. Недавняя работа австралийских ученых также не подтвердила значения наследственной тромбофилии в патогенезе данной патологии [10]. В исследовании Dalmaz C. и соавт. показано отсутствие ассоциации отдельных SNPs с преэклампсией, но было идентифицировано совместное влияние на развитие ПЭ полиморфизмов генов MTHFR, FII, FV и PAI-1 [7]. Роль комбинации генетически обусловленных факторов тромбофилии на развитие осложненного течения беременности была также продемонстрирована в работе Vefring H. и соавт. – при сочетании гомозиготных вариантов 677ТТ гена MTHFR и 1691АА гена FV наблюдалось пятикратное повышение риска ПЭ, в то время как носительство генотипа 677ТТ увеличивало риск данной патологии только в два раза [15]. В данном исследовании также была показана ассоциация полиморфизма –675 4G/5G гена PA1-1, являющегося одним из важнейших генов плазменного звена гемостаза. Аналогичные данные были получены также в работе японских [16], немецких [9] и отечественных авторов [2]. Протеин PAI-1 регулирует тканевый/уро-киназный активаторы плазминогена. Носительство аллеля 4G приводит к повышенной экспрессии гена и увеличенному уровню PAI-1 в крови, снижению активности тромболитической системы и возрастанию риска тромбооб-разования [8]. Показано, что гомозиготная мутация 4G/ 4G полиморфизма –675 4G/5G является фактором риска для развития тромбозов и инфаркта миокарда [12].

Результаты проведенного исследования позволяют с большой долей вероятности предположить, что аллельные варианты 677Т и 1298С гена MTHFR и 4G/5G-поли-морфизм гена PA1-1 вносят значительный вклад в развитие гестоза и могут быть учтены при выборе эффективной профилактической тактики ведения пациента.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-04-99028-р_офи).