Молекулярно-генетический анализ маркера М235Т гена ангиотензиногена в популяциях различного этнического происхождения при гестозе

На сегодняшний день одним из наиболее тяжелых и распространенных осложнений беременности остается гестоз, определяющий в значительной мере уровень перинатальной заболеваемости и смертности. Несмотря на существенные достижения отечественной и зарубежной медицины в комплексной терапии гестоза, частота его развития не имеет тенденции к снижению и составляет от 15,5 до 30,5% [4]. Последнее указывает на необходимость дальнейшего изучения патогенеза гестоза на мо- лекулярно-клеточном, органном и системном уровнях, а также разработки высокоэффективных методов профилактики, диагностики и терапии гестоза, что позволит выявить и обеспечить мониторинг чувствительных метаболических и функциональных расстройств, свойственных прогрессирующим формам гестоза в целях оценки эффективности терапии и прогнозирования течения беременности, исхода родов.

Ведущие клинические проявления гестоза связаны с развитием гипертензивного и отечно-протеинурического синдромов. В свою очередь, инициирующими патогене- тическими факторами в развитии гипертензии при гес-тозе являются расстройства нейрогенного и базального тонуса сосудов, эндотелиальная дисфункция, нарушения микроциркуляции, прежде всего в почках, приводящие к активации ренин-ангиотензиновой системы (РАС) [4]. Как известно, эндотелию отводится важная роль в регуляции кровоснабжения, оксигенации и трофики различных органов и тканей. Эндотелий является местом синтеза диаметрально противоположных по своим биологическим эффектам веществ, обладающих сосудосуживающим и вазодилатирующим эффектом, тромбогенных и анти-тромбогенных факторов [1]. Одним из наиболее значимых вазоконстрикторов РАС является ангиотензиноген.

Ген ангиотензиногена (AGT) локализован на длинном плече 1-й хромосомы в локусе 1q42-q43 [6]. AGT экспрессируется преимущественно в печени и находится под контролем эстрогенов, глюкокортикоидов, тиреоидных гормонов и ангиотензина 2. На сегодняшний день в гене AGT известно уже более 250 полиморфных сайтов [11]. Среди обнаруженных к настоящему времени аллелей гена AGT в качестве генетических маркеров предрасположенности к гестозу чаще всего рассматриваются полиморфные варианты Т174М и М235Т. Полиморфным вариантом, включенным в наше исследование, является однонуклеотидная замена тимина на цитозин в 704-м положении второго экзона гена ангиотензиногена, приводящая к замене Мет ^ Thr в положении 235 конечного продукта (М235Т) [6].

В данном исследовании мутация 235Т представляет интерес, прежде всего, в связи с патологическими состояниями, ведущими к повышению на 15–20% уровня ангиотензина 1 в крови, что и является одним из факторов сердечно-сосудистой патологии. Большинство исследователей обнаруживают связь ТТ-генотипа с более вероятным развитием гипертонической болезни [14], с более высоким уровнем артериального давления [13] и более высокой концентрацией ангиотензинпревращающего фермента в плазме крови [14]. К тому же частота встречаемости 235Т-аллеля повышена у больных с врожденной гипертензией [14], и при изучении беременных женщин наблюдается сопряженный с ней риск преэклампсии [9, 21]. Также 235Т-аллель гена AGT ассоциирован с гипертензией, индуцированной беременностью [6, 19, 27], в разных этнических популяциях, в том числе и в популяции Объединенных Арабских Эмиратов, характеризующейся полным отсутствием таких факторов риска, как употребление алкоголя и курение.

Изучение функциональной значимости полиморфизма М235Т осложняется этническими различиями в распределении аллелей. Так, в японской популяции 235Т-ва-риант гена встречается гораздо чаще [19], чем в европейской расе, а среди чернокожего населения Америки частота 235Т-аллеля вдвое превосходит таковую среди представителей белой расы [14]. В связи с вышеизложенным представляется важным исследование связи распространенного полиморфного варианта М235Т гена AGT у женщин с осложненным течением беременности в различных этносах.

Цель настоящей работы: молекулярно-генетический анализ полиморфизма М235Т гена ангиотензиногена

(AGT) в популяциях различного этнического происхождения при гестозе.

Материал и методы

В рамках исследования полиморфизма генов, ответственных за развитие эндотелиальной дисфункции, была изучена частота аллельного варианта М235Т гена ангиотензина (AGT). В исследуемую группу вошли 924 беременные из трех популяций (якуты, Якутск, n=329, буряты, Улан-Удэ, n=305 и русские, Томск, n=290), из них 494 пациентки с гестозом. Контрольную группу составили женщины с физиологическим течением беременности в анамнезе. У обследованных индивидуумов была выделена ДНК, проамплифицирован интересующий локус М235Т (С704Т) гена AGT с последующим рестрикционным анализом с помощью специфической эндонуклеазы BstFN I (BstU I). Продукты амплификации и рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 3%-м агарозном геле.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета статистических программ STATISTICA 7.0. Различие двух сравниваемых величин считалось статистически значимым при уровне значимости р<0,05. Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий Шапиро–Уилка [24]. Соответствие распределения частот аллелей и генотипов по исследованным генам равновесию Харди–Вайнберга проверяли по критерию % ². В исследуемых группах для полиморфных вариантов вычисляли отношение шансов OR=ad/bc, где а – частота анализируемого аллеля у больных; b – частота анализируемого аллеля в контрольной выборке; c и d – суммарная частота остальных аллелей у больных и в контроле соответственно и доверительные интервалы (Cl) для отношения шансов (95% Cl) по формуле:

ln( O^ ) ± 1,96 х 7 var(ln( O^ )) .

Результаты и обсуждение

Нами был изучен полиморфизм М235Т гена AGT, представляющий интерес в связи с патологическими состояниями, ведущими к нарушению функционирования РАС, играющей ключевую роль в регуляции кровяного давления, ренальной гемодинамики, водного и электролитического гомеостаза.

Распределение частот аллелей и генотипов, а также соответствие распределение генотипов равновесию Харди–Вайнберга, полученные в данном исследовании, представлены в таблице 1. Наблюдаемое распределение генотипов соответствовало равновесию Харди–Вайнберга во всех изученных группах, а частоты аллелей и генотипов находились в диапазоне мировых. При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов между больными ге-стозом и контрольной группы не было установлено статистически значимых различий ни в одной из обследованных популяций.

Литературные данные о связи полиморфизма М235Т гена AGT с нарушением физиологического течения бе- ременности весьма противоречивы. Так, например, голландские ученые в своем исследовании ассоциации анамнестических данных родивших пациенток и маркера М235Т показали, что наличие 235Т-аллеля связано с гипертензивными нарушениями во время беременности [27]. В то же время E. Knyrim и коллеги (2008) в аналогичном исследовании, проведенном в немецкой популяции, не установили связи между осложнением течения беременности и наличием полиморфного варианта M235T гена AGT [18]. Американские ученые, исследовавшие связь полиморфизма M235T c риском проявления преэклампсии в популяциях афроамериканских женщин и европеоидных американок, продемонстрировали, что частота мутантного аллеля различна в этих популяциях, но вместе с тем, связи с риском преэклампсии в этих популяциях установлено не было [14].

Относительно ассоциации с гестозом полиморфного варианта М235Т гена AGT у женщин монголоидной расы, представители которой также были обследованы в нашей работе, существуют следующие данные: в популяции корейских женщин ассоциации полиморфизма M235T гена AGT c преэклампсией не установлено [17]; в популяции китайских женщин (город Чэнду) также показано отсутствие связи между частотой 235Т-аллеля и риском возникновения артериальной гипертензии у беременных женщин данной популяции [8]. Однако стоит отметить, что существует ряд работ, подтверждающих ассоциацию полиморфизма М235T гена AGT с заболеваниями сердечно-сосудистой системы и почек у представителей монголоидной расы. Имеются сообщения о наличии связи полиморфного варианта М235T гена AGT и повышенным риском заболевания эссенциальной гипертензии в популяции монголов [26], это подтверждают и китайские авторы, проводившие свои исследования в популяции Пекина [25]. Аналогичные результаты получены и для малазийской популяции [23].

Анализ отечественной литературы показал незначительное количество работ по изучению ассоциаций полиморфизма М235Т гена AGT с развитием гестоза. В одной из недавних работ не было обнаружено связи аллелей М235Т гена AGT с гестозом у первородящих женщин [3]. Аналогичные результаты были получены и для другого полиморфного варианта Т174М гена AGT при изучении наследственной предрасположенности к данной патологии у бурятских женщин [2].

Было показано, что единичная замена метионина на треонин в позиции 235 сопровождается увеличением количества циркулирующего ангиотензина примерно на 20% (у гомозиготных носителей) и повышением артериального давления. Впоследствии в промоторной области гена AGT был выявлен полиморфизм -6G/A (замена гуанина на аденин в положении -6), который оказался сцеплен с полиморфизмом М235Т, что объясняет ассоциацию последнего с изменением уровня экспрессии ангиотен-зиногена и его концентрации в плазме крови [15]. Для более полного и детального понимания механизма взаимосвязи между полиморфизмами гена AGT и уровнем ангиотензина в плазме крови секвенировали область гена AGT протяженностью 14,4 килобаз у представителей европеоидной и монголоидной рас и идентифицировали 44 однонуклеотидных полиморфизма, 42 из которых были общими для обеих исследованных популяций [20]. Также в данной работе было продемонстрировано что, несмотря на общее сходство в характере неравновесия по сцеплению в этих двух популяциях, гораздо более высокая частота M235-связанных гаплотипов была идентифицирована для европейской популяций, что может объяснять наличие ассоциации маркера М235Т с муль-

Таблица 1

Распределение генотипов и частот аллелей в изученных популяциях

Полиморфиз C704T (М235Т) гена AGT		Исследуемые группы
		Русские		Якуты		Буряты
		Группа с гестозом, n=140	Контрольная группа, n=150	Группа с гестозом, n=214	Контрольная группа, n=115	Группа с гестозом, n=140	Контрольная группа, n=165
Частоты генотипов, %	СС СТ ТТ	29 42 29	30 42 25	40 42 18	37 46 17	47 44 9	56 32 12
Значение критерия χ 2 с поправкой Йейтса, (уровень значимости р)*		0,46 (р=0,80)		0,49 (р=0,78)		4,46 (р=0,11)
Частоты аллелей, %	С Т	50 50	52 48	61 39	60 40	69 31	72 28
Значение критерия χ 2 с поправкой Йейтса, (уровень значимости р)*		0,24 (р=0,62)		0,04 (р=0,84)		1,01 (р=0,321)
Уровень значимости соответствия равновесию Харди– Вайнберга, р		0,21	0,37	0,22	0,78	0,82	0,10

Примечание: n – количество индивидов в группе. * – значение критерия χ ² с поправкой Йейтса и уровень значимости р получены при сравнении частот аллелей или генотипов контрольной группы и группы больных гестозом.

тифакториальными состояниями в одних этнических группах мира и отсутствие взаимосвязи в других.

Разнообразие по полиморфным вариантам, имеющим адаптивную значимость, как правило, может определяться действием естественного отбора в определенных этнических или географических группах населения, характеризующихся различными условиями внешней среды. Частоты аллелей полиморфных вариантов будут различными между этническими или географическими группами, если в качестве факторов естественного отбора выступают условия среды обитания, что продемонстрировано рядом исследований [10, 12, 22] и подтверждается результатами, полученными в данной работе при сравнительном анализе частот аллелей и генотипов между изученными этнотер-риториальными группами – русских, якутов и бурят. Наиболее высокая частота аллеля Т и генотипа ТТ отмечается в популяции русских, как у больных, так и в контрольной группе по сравнению с якутами и бурятами, что может быть обусловлено эволюционной историей формирования данных популяций (табл. 1).

В данной работе был также проведен анализ распределения частот аллеля 235Т гена AGT в различных этнических выборках мира, результаты которого представлены в таблице 2. Можно сделать заключение, что аллель 235Т

Таблица 2

Частота 235Т-аллеля гена AGT в различных популяциях мира

Географический регион	Популяция	Выборка (n)	Частота аллеля 235T
Европеоиды
Азия	Белуджи	50	0,360
Азия	Палестинцы	102	0,480
Европа	Друзы	202	0,312
Европа	Самаритяне	80	0,313
Европа	Евроамериканцы	956	0,400
Европа	Финны	70	0,514
Европа	Французы	1716	0,584
Европа	Венгры	176	0,540
Европа	Ирландцы	224	0,585
Европа	Русские	94	0,606
Европа	Евреи-ашкенази	158	0,519
Азия	Коми-зыряне	94	0,532
Азия	Пакистанцы	60	0,250
Европа	Эстонцы	1952	0,500
Монголоиды
Азия	Ханты	100	0,380
Восточная Азия	Китайцы	414	0,130
Восточная Азия	Ами	80	0,075
Азия	Монголы	48	0,271
Восточная Азия	Японцы	548	0,190
Восточная Азия	Корейцы	108	0,194
Сибирь	Якуты	102	0,441
Восточная Азия	Тайваньцы (Атаял)	82	0,098
Северная Америка	Майя, Юкатан	102	0,180
Негроиды
Азия	Бедуины	96	0,440
Африка	Биака	136	0,044
Африка	Хауса	78	0,128
Африка	Мбути	76	0,040
Африка	Йоруба-говорящие	154	0,084
Африка	Афро-американцы	180	0,200
Африка	Мозабиты	60	0,500
Африка	Банту-говорящие	24	0,130

Примечание: информация получена из базы данных [5].

распространен в различных популяци ях с большой гетерогенностью (табл. 2). Максимальная частота аллеля 235Т (60%) зафиксирована у русских (Вологодская область), минимальная (4%) – в племени Мбу-ти (Южная Африка). При анализе частоты 235Т-аллеля внутри монголоидной и европеоидной рас, к которым принадлежат исследованные нами популяции, получены следующие результаты: среди монголоидной расы частота аллеля 235Т варьирует от 7% (ами) до 44% (якуты), частота данного аллеля среди европейцев колеблется от 25% (пакистанцы) до 60% (русские). По нашим данным, в русской популяции частота аллеля 235Т составила 50%, в популяции якутов этот аллель встречается с частотой 39%, а в популяции бурят 31%. Таким образом, частоты аллеля 235Т гена AGT, полученные в данном исследовании, находятся в диапазоне мировых.

Заключение

Полученные в настоящей работе данные по изучению полиморфного варианта M235T гена AGT в популяциях русских, бурят и якутов дополняют сведения о вариабельности этого гена у населения мира и могут служить основой для дальнейших исследований роли гена AGT в подверженности к гестозам и другим мультифакториаль-ным состояниям в популяциях различного этнического происхождения.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 09-04-99028-р_офи, № 11-04-98043-р_сибирь_а).