Молекулярно-генетический анализ полевых изолятов вируса болезни Ньюкасла, выделенных в Таджикистане

Болезнь Ньюкасла (БН) является одним из самых значимых и распространённых заболеваний домашней птицы во всем мире. Болезнь наносит большой экономический ущерб птицеводству во многих частях мира. Возбудитель болезни Ньюкасла (ВБН) принадлежит к роду Avulavirus семейства Paramyxoviridae [6]. Вирусы рода Avulavirus подразделяются на девять серотипов (APMV-1-9) на основании анализа ингибирования гемагглютинации (HI) и ингибирования нейраминидазы (NI) [3]. Все штаммы ВБН содержат парамиксовирусов птиц серотип 1 (APMV-1). Поскольку ВБН является важным патогеном домашней птицы, APMV-1 является наиболее широко охарактеризованным серотипом среди парамиксовирусов птиц [10, 11].

Из всех встречающихся в природе штаммов вируса болезни Ньюкасла APMV-1, является единственным хорошо охарактеризованным серотипом из-за его экономической значимости. Полные последовательности генома определены для ряда штаммов БН, имеется обширная информация о молекулярной биологии и патогенезе ВБН. Однако следует отметить что, биологические характеристики и патогенность этих штаммов остаются плохо изученными. Штаммы APMV-2 характеризуются легкими респираторными заболеваниями, снижением яйценоскости и бесплодием у индеек [7]. В то время как APMV-3 вызывает энцефалит и высокую смертность у кур, респираторные заболевания у индеек и задержкой роста у моло- дых цыплят. Штаммы APMV-4 были выделены у кур, уток и гусей [12]. Штаммы APMV-5 ответственны за заболевание у волнистых попугайчиков (Melopsittacusundulatus), вызывают, одышку, диарею, кривошею и острый фатальный энтерит, что приводит к очень высокой смертности [8]. Штаммы APMV-6 впервые выделены у домашней утки, и было обнаружено, что он вызывает легкое респираторное заболевание и снижение яйценоскости у индеек, но относительно кур эти штаммы авирулентные [4]. Штаммы APMV-8 выделены у гусей и дикой утки шилохвости [13]. Штаммы APMV-9 изолированы у уток по всему миру [5].

Штамм APMV-7 был впервые выделен из убитого охотником голубя в 1975 году, в США, в штате Теннесси и был разработан как новый серотип, основанный на анализах ингибирования гемагглютинации и ингибирования нейраминидазы. APMV-7 был выделен в результате естественной вспышки заболевания дыхательных путей в коммерческих племенных стадах индеек в Огайо, в 1997 году. Инфекция APMV-7 вызывала у индеек респираторные заболевания аэросаккулит и снижение яйценоскости [9].

Целью исследований стало определение характеристики изолятов вируса болезни Ньюкасла, вызвавших заболевание птиц в различных регионах Республики Таджикистан с 2014 по 2017 годы.

Результат исследования. Осенью 2017 г. в частном секторе Гиссарского района Республики Таджикистана среди цыплят 45-дневного возраста возникла вспышка БН. Собранный патологический материал происследовали методом ОТ– ПЦР и получили положительные результаты со специфических продуктов ампликон в размере 300 пар оснований.

Дальнейшие исследования проведены совместно со специалистами Шведского национального ветеринарного университета г. Упсала с целью изучение филогенетического дерева изолята вируса болезни Ньюкасла, выделенного в Таджикистане.

Было проведено секвенирования участка гена F имеющихся в международной базе данных полных нуклеотидных последовательностей, как ген, отвечающий за вирулентность вируса болезни Ньюкасла. По результатам секвенирования проведено сравнение выделенного полевого штамма с другими штаммами вируса болезни Ньюкасла в интернет базе данных GeneBank, с помощью пакета программ MEGA6. Полученные результаты приведены на рисунке 1.

Classll GenotypeXVIlla 374252473 APMV1 chicken NL 152608 93

1 Classll GenotypeVllh 359358674 chicken Sukorejo 01910

981 Classll GenotypeVllf 326581500 ND 03 018

I Classll GenotypeVllf 4929108 LZ NDVF m I— Classll GenotypeVllh 943359422 turkey SouthAfrica N2057 2013

Classll GenotypeVlle 663085205 go CH GD QY1997

G112-RRQKRFIGA-116V

The evolutionary history was inferred using the Maximum likelihood method based on the Tamura-Nei model using 300bp of the fusion gene of representative avian avulavirus type 1. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (2000 replicates) are shown next to the branches,

Classll GenotypeVlle 398330288| XJ 2 97

Classll GenotypeVlld 22657972 Goose PMV SF02

Classll GenotypeVlld Md CH LGD 1 2005

881 Classll GenotypeVllh 751995699 Md CH LGD 1 2005

......................... • AAvA1 Chicken Tadjikistan Gissor 6

Classll GenotypeVlli 359358667 chicken Banjarmasin 010 10

Classll GenotypeVlli 908758108 chicken NDV Rak AW 14

chicken Pakistan Sheikhupura 12A 994 2015

Рисунок 1 – Дендрограмма Гиссарского изолята вируса болезни Ньюкасла по антигенному родству полученый в 2017 году

Результаты молекулярнобиологического исследования в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и методом нуклеинового секвенирования генома, позволили идентифицировать изолят от домашних птиц, относящийся к авулавирусу птиц серотипа -1, генотипа-7i (VIIi)вирус БН (Avi-anAvulavirustype 1).

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей в области гена F позволил установить, полевой штамм БН, выделенный на территории республики Таджикистан, относится к генотипу VII, который имеет тесное сход- ство со штаммами, выделенными в странах Южной Азии, в Шри-Ланке и Пакистане [2].

Выяснилось, что также вспышки болезни Ньюкасла в республике наблюдались в 2014 году, в птицеводческих хозяйствах Согдийской области и последующем в 2016 году, в птицеводческих хозяйствах города Гиссар, районов Шахринав и Рудаки республики Таджикистан. Результаты, полученные в 2014 году, позволили идентифицировать изолят ВБН как парамиксовируса серотипа – 1 генотипа 7 относящегося к группе велогенных штаммов (Рисунок 2) [1].

пЛбО'Амле» - genotype I

NOV4-C-genotype I

HX01 - genotype 0 VRDCVentnLaSotaY/S - genotype II APfHV-T-Ca^S-?! - genotype V Chimalbuacan • genotype V Chicken_Sweden_95 • genotype VI NDVSyTNMamakkal - genotype IV APMV-1W15260M3-genotype Vila Japanlbaraki'SGIO^ 1999 ■ genotype VI PheasantW20'Paloslan/'20l1 - genotype VII NDVtPak/AW-14 - genotype Vlli

PaWSFM1in3-genotype V» Isolate Tadjikistan

VaccmeH39 - genotype III

Рисунок 2 – Дендрограммаизолята вируса болезни Ньюкасла от цыплят-бройлеров по антигенному родству выполненный в 2014 г.

Рисунок 3 – ДендрограммаизолятаNDV/Tajikistan/3411/2016 вируса болезни Ньюкасла по антигенному родству

В 2016 году, филогенетический анализ секвенированных генов ПМВ, с полными нуклеотидными последовательностями, проводили с помощью компьютерной программы MEGA 6.06, для после- довательностей фрагмента гена F, длиной 527 нуклеотидов (нуклеотиды 199-725 ОРС гена F), изученного изолята и 275 опубликованных в базе данных GenBank.

Полученные данные приведены на рисунке 3.

Результаты исследования показали, что полевой штамм, выделенный в 2016 году у домашних птиц, также принадлежит к роду Авулавирусу птиц серотипа - 1, генотипа – 7.

Заключение. Исследования, проведенные в последние годы в республике, показывают, что выделенные полевые штаммы ВБН в хозяйствах Северного и Центрального Таджикистана относятся к генотипу VII. Это говорит о том, что, несмотря на разное месторасположение хозяйств, штаммы ВБН, циркулирующие на территории Таджикистана, аналогичны.

Резюме

Заболевания и гибель домашних птиц в Республике Таджикистан в последние годы были вызваны вирусом болезни Ньюкасла. Вспышки болезни Ньюкасла зарегистрированы в птицеводческих хозяйствах Согдийской области и районах республиканского подчинения в период с 2014 по 2017 гг. По результатам секвенирования проведено сравнение выделенного полевого штамма с другими штаммами вируса болезни Ньюкасла в интернет базе данных GeneBank с помощью пакета программ MEGA6. Результаты исследований показали, что выделенные от домашних птиц штаммы ВБН на территории Таджикистана в периоды с 2014 по 2017 гг. принадлежат к авулавирусу птиц серотипа -1, генотипа-7.