Молекулярно-генетический анализ популяций Pinus sylvestris L. и Pinus sibirica du Tour в Пермском крае на основании полиморфизма ISSR-PCR маркеров

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 575.2:575.22:574.3                            

Генетическое разнообразие и внутривидовая дифференциация имеют важное биосферное и ресурсное значение. Для решения современных проблем сохранения и возобновления лесов необходима оценка биоразнообразия лесных экосистем, важным элементом которой является изучение генетического разнообразия популяций основных лесообразующих видов растений [1]. Разработка и обоснование комплекса мероприятий, направленных на максимальное сохранение генетического разнообразия лесообразующих видов в различных условиях должна основываться на данных о генетической структуре и состоянии генофондов их популяций [2].

Сосна сибирская ( Pinus sibirica Du Tour) и сосна обыкновенная ( Pinus sylvestris L.) являются ценными хозяйственными видами, а также одними из основных эдификаторов лесных экосистем бореальной зоны Евразии. Высокая экологическая пластичность и хозяйственная ценность сосны сибирской и сосны обыкновенной давно привлекают внимание генетиков и селекционеров к проблеме изучения, сохранения и воспроизводства генофондов этих видов.

Цель работы — сравнительный анализ генетического разнообразия и генетической структуры популяций P. sylvestris и P. sibirica в Пермском крае на основании полиморфизма межмикросателлитных маркеров.

Материалы и методы исследований

В качестве объектов для сравнительного анализа генетического разнообразия и генетической структуры избраны популяции двух видов древесных растений (Pinus sylvestris L. и Pinus sibirica Du Tour; Pinaceae), расположенные в центральной и северной частях Пермского края. Исследованы 3 популяции сосны сибирской (P. sibirica), расположенные в Красновишерском лесничестве (Ps_Kr), Кочевском лесничестве (Ps_Kh) и на территории ФГБУ «Государственный заповедник «Басеги»» (Ps_Bs) (Таблица 1). Среди изученных популяций сосны сибирской на наибольшем географическом расстоянии (268 км) находятся популяции Ps_Kh и Ps_Bs, а на наименьшем — Ps_Kr и Ps_Bs (176 км). Исследованные три популяции P. sylvestris находятся на территории Березниковского лесничества (Psl_Br), Закамского лесничества (Psl_Zc) и Кишертского (Psl_Ks) лесничества (Таблица 1). При этом наиболее географически удаленными являются популяции Psl_Br и Psl_Ks (260 км), а на наименьшем географическом расстоянии находятся популяции Psl_Ks и Psl_Zc (105 км).

Таблица 1.

ИЗУЧЕННЫЕ ПОПУЛЯЦИИ P. SIBIRICA И P. SYLVESTRIS

Обозначение популяций	Расположение популяций	Объем выборки, шт.	Координаты (с. ш.; в. д.)
Ps_Kr	Красновишерский  район,  Красновишерское лесничество	17	N: 60.11 E: 57.44
Ps_Kh	Кочевский район, Кочевское лесничество	30	N: 59.39 E: 54.39
Ps_Bs	Горнозаводский район, Государственный заповедник «Басеги», Горнозаводское лесничество	29	N: 58.56 E: 58.30
Psl_Ks	Кишертский район, Кишертское лесничество	28	N:57.08 E:57.23
Psl_Br	г. Березники, Березниковское лесничество	28	N:59.40 E:56.70
Psl_Zc	Пермский район, Закамское лесничество,	28	N:57.96 E:56.16

Примечание : популяции P. sibirica : Ps_Kr — расположена в Красновишерском лесничестве; Ps_Kh — в Кочевском лесничестве; Ps_Bs — в Горнозаводском лесничестве; популяции P. sylvestris: Psl_Ks — из Кишертского лесничества; Psl_Br — из Березниковского лесничества; Psl_Zc — из Закамского лесничества; с. ш. — северная широта; в. д. — восточная долгота.

Для проведения молекулярно-генетических исследований были собраны образцы хвои в 6 популяциях P. sibirica и P. sylvestris с 106 деревьев. Сбор образцов осуществлялся со случайно выбранных деревьев, расположенных на расстоянии не менее 100 метром друг от друга. ДНК из хвои выделяли по методике С. Роджерса [3], модифицированной с использованием в качестве сорбента PVPP (polyvinylpolypyrrolidone) [4]. Качество и характеристики ДНК определяли на приборе Spectrofotometr ^TM NanoDrop 2000 (Thermo scientific, USA). Для оценки генетического разнообразия и генетической структура популяций был применен ISSR- (Inter Simple Sequence Repeats) метод анализа полиморфизма ДНК [5]. Для проведения ПЦР были использованы эффективные для P. sibirica ISSR-PCR праймеры, которые были подобраны ранее [6]: ISSR-9 [(ACG)7G]; CR-217 [(GT) 6 GG]; CR-215 [(CA) 6 GT]; M1 [(AC) 8 CG]; X11 [(AGC) 6 G)]. Для ПЦР с пробами ДНК P. sylvestris также использовались ранее подобранные эффективные праймеры [7]: ISSR-1 [(АС) 8 T]; CR-212 [(CT) 8 TG]; CR-215 [(CA) 6 GT]; M27 [(GA) 8 C]; X10 [(AGC) 6 C)].

Для ПЦР использовали реакционную смесь объемом 25 мкл, содержащую: 0,4 мкл Tag-полимеразы; 2,5 мкл стандартного 10× буфера для ПЦР; 0,25 мкл праймера; 2,5 мкл Mg ²⁺ ;

0,25 мкл dNTP; 5 мкл тотальной ДНК. В качестве отрицательного контроля (К-) для проверки чистоты реактивов к реакционной смеси вместо ДНК добавляли 5 мкл деионизированной воды. Амплификацию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) по типичной для ISSR-PCR метода программе: предварительная денатурация 94 °C, 2 мин.; первые пять циклов 94 °С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72 °С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t° отжига, 5 сек.; 72 °С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин при 72 °С. Температура отжига в зависимости от G/С-состава праймеров варьировала от 52 °С до 64 °С. Продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле в 1× ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе Gel-Doc XR (Bio-Rad, USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 + bp+DNA Ladder; ЗАО «Евроген», Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы QuantityOne в системе гель-документации Gel-Doc XR (Bio-Rad, USA). Изучен полиморфизм 102 ISSR-PCR маркеров в 3 популяциях P. sibirica и 113 ISSR-PCR маркеров в 3 популяциях P. sylvestris.

Компьютерная обработка данных проведена с помощью программы POPGENE 1.31 [8] и с помощью специализированного макроса GenAlEx6 [9] для MS-Excel с определением: доли полиморфных локусов ( P 95 ) [10], абсолютного числа аллелей ( n a ), эффективного числа аллелей ( n e ) [11], ожидаемой гетерозиготности ( H E ) [12]. Анализ генетической структуры проведен в соответствии с методикой М. Нея [13]. Генетическое расстояние между популяциями определяли по формуле M. Нея и В. Ли [14]. Была рассчитана матрица генетических различий, на основании которой невзвешенным парно-групповым методом UPGMA (unweighted pair-group method using arithmetic average) была построена дендрограмма, отражающая степень сходства исследуемых популяций по ISSR-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b. Для определения корреляции между генетическими и географическими расстояниями был применен общепринятый тест Мантела [15].

Результаты и их обсуждение

В результате молекулярно-генетического анализа популяций P. sibirica выявлено 102 ISSR-PCR маркера, из которых 88 были полиморфными ( P 95 =0,863). В ходе анализа полиморфизма ДНК популяций P. sylvestris было обнаружено 113 ISSR-PCR маркеров (Таблица 2), из которых 100 являлись полиморфными ( P 95 =0,885). Соответственно, доля полиморфных локусов незначительно выше у изученных популяций P. sylvestris.

Число амплифицированных ISSR-PCR маркеров у P. sibirica варьировало в зависимости от праймера от 17 (M1 [(AC) 8 CG]) до 25 (X11 [(AGC) 6 G]). В популяциях P. sylvestris максимальное число ISSR-PCR маркеров, равное 27, выявлено в ПЦР с праймером CR-212 [(CT) 8 TG], а минимальное (20) с праймерами ISSR-1 [(АС) 8 T] и M27 [(GA) 8 C]. Размеры ISSR-PCR маркеров в исследованных популяциях P. sibirica изменялись (Таблица 2) в зависимости от праймера в пределах от 190 п.н. (M1 [(AC) 8 CG]) до 1570 п.н. (CR-217 [(GT) 6 GG]). В популяциях P. sylvestris размеры амплифицированных ISSR-PCR маркеров варьировали в зависимости от праймера от 210 п.н. (X10 [(AGC) 6 C]) до 1400 п.н. (CR-212 [(CT) 8 TG]). Ожидаемая гетерозиготность ( H E ) у P. sibirica составила 0,195, что незначительно превышает значения этого показателя у P. sylvestris (H E = 0,166).

Таблица 2.

ISSR-праймер Последовательность (5'→3') Длина фрагментов, п.н. Общее число полиморфных ISSR-PCR маркеров (их частота) N            P P. sibirica ISSR-9 (ACG)7G 200-1030 21 19 (0,905) X11 (AGC)6G 230-1220 25 22 (0,880) M1 (AC)8CG 190-1320 17 12 (0,706) CR-215 (CA)6GT 200-970 19 16 (0,842) CR-217 (GT)6GG 250-1570 20 19 (0,950) Всего 102 88 (0,863) P. sylvestris ISSR-1 (АС)8T 220-930 20 17 (0,850) CR-212 (CT)8TG 270-1400 27 26 (0,963) CR-215 (CA)6GT 220-1000 25 24 (0,960) M27 (GA)8C 240-1000 20 15 (0,750) X10 (AGC)6C 210-1100 21 18 (0,857) Всего 113 100 (0,885) Примечание: N — общее число ISSR-PCR- маркеров, P — число полиморфных ISSR-маркеров, в скобках дана их частота.

ХАРАКТЕРИСТИКА ISSR-PCR-МАРКЕРОВ P. sibirica И P. sylvestris

Однако, эффективное число аллелей ( n e ) значительно (Таблица 3) выше у P. sibirica ( n e = 1,335 ) по сравнению с P. sylvestris ( n e = 1,268).

СРАВНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ

ДВУХ ВИДОВ РОДА PINUS

Таблица 3.

Выборка	P 95	H E	n e	n a
Популяции P. sibirica	0,863	0,195 (0,011)	1,335 (0,021)	1,330 (0,048)
Популяции P. sylvestris	0,885	0,166 (0,010)	1,268 (0,018)	1,212 (0,051)
Критерий	Фишера (F)		Критерий Стьюдента (t)
Значение критерия	F=0,419	F=0,477	t=2,420	t=1,680
Сравнение с F st или t st	0,419 < 1,960	0,477 < 1,960	2,420 > 1,977	1,680 < 1,977

Примечание: P 95 — доля полиморфных локусов, H E — ожидаемая гетерозиготность; n e — эффективное число аллелей на локус; у H E и n e в скобках даны стандартные отклонения.

Число редких аллелей выше у P. sylvestris (R=29) по сравнению с P. sibirica (R=18). Анализ генетической структуры трех популяций P. sibirica показал (Таблица 4), что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов на общую выборку ( H T ) составила 0,287. Этот показатель выше, чем ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции ( H S =0,196). Наибольшая дифференциация популяций сосны сибирской установлена с использованием праймера X-11 [(AGC) 6 G]. Установлено, что доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или коэффициент подразделенности ( G ST ) составил 0,320.

У P. sylvestris доля гетерозиготных генотипов на общую выборку ( H T ) составила 0,238, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции ( H S =0,196). Наибольшая дифференциация популяций сосны обыкновенной выявлена с использованием праймера CR-215 [(CA) 6 GT]. Коэффициент подразделенности ( G ST ) у P. sylvestris равен 0,303 (Таблица 4).

Таблица 4.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ

ИЗУЧЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ДВУХ ВИДОВ РОДА PINUS

ISSR- PCR праймер	Нуклеотидная последовательность (5'→3')	H T	H S	G ST
P. sibirica
CR-217	(GT) 6 GG	0,312 (0,017)	0,227 (0,013)	0,272
CR-215	(CA) 6 GT	0,260 (0,028)	0,192 (0,020)	0,264
ISSR-9	(ACG) 7 G	0,260 (0,028)	0,192 (0,020)	0,264
M-1	(AC) 8 CG	0,303 (0,031)	0,231 (0,022)	0,239
X-11	(AGC) 6 G	0,274 (0,030)	0,167 (0,017)	0,390
Среднее		0,287 (0,027)	0,196 (0,018)	0,320
P. sylvestris
ISSR-1	(АС) 8 T	0,281 (0,028)	0,171 (0,010)	0,391
CR-212	(CT) 8 TG	0,261 (0,020)	0,211 (0,015)	0,190
CR-215	(CA) 6 GT	0,251 (0,027)	0,156 (0,009)	0,379
M27	(GA) 8 C	0,177(0,022)	0,133 (0,010)	0,248
X10	(AGC) 6 C	0,209(0,021)	0,145 (0,007)	0,307
Среднее		0,238(0,024)	0,166 (0,011)	0,303

Примечание: H T — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; H S — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в отдельной популяции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; G ST — доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения.

Установлено, что доля межпопуляционного генетического разнообразия ( G ST ) близка у обоих исследованных видов рода Pinus . При этом значение данного показателя (G ST = 0,320 ) у P. sibirica незначительно выше, чем у P. sylvestris ( G ST = 0,303). В целом, можно сказать, что популяции исследованных видов рода Pinus дифференцированы в средней степени, поскольку на межпопуляционную компоненту у P. sibirica приходится около 32,0% всей генетической изменчивости, а у P. sylvestris – 30,3%.

При подсчете попарных генетических расстояний было установлено, что у P. sibirica на наименьшем генетическом расстоянии (D =0,157) находятся популяции Ps_Kr и Ps_Bs , а на наибольшем ( D =0,213) популяции Ps_Kh и Ps_Bs . У P. sylvestris наиболее генетически удаленными являются популяции Psl_Ks и Psl_Br ( D =0,187), а на наименьшем генетическом расстоянии расположены популяции Psl_Br и Psl_Zc ( D =0,042) .

На основании матриц попарных генетических расстояний ( D ) был проведен кластерный анализ невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA) и построены дендрограммы, отражающие степень сходства по ISSR-спектрам исследуемых популяций каждого вида. На дендрограмме популяции P. sibirica Ps_Kr и Ps_Bs сформировали 1 кластер, к ним примыкает популяция Ps_Kh (Рисунок 1А).

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 7. №4. 2021

0.4               0.3               0.2               0.1

A-------------------I--------------------!-------------------1--------------------

1001--------------------------------------------------------- Ps_Kr

I--Ps_Bs

_______________________________________________________________ Ps Kb

A

M #5         0.4 U 02         0.1

4-------------------1-------------------1-------------------1-------------------1-------------------1-------------------

100 I                                                                              Psi Br

---------------1____________________________________________________________________________ Psi Zc _______________________________________________________________________________ Psi Ks

Б

Рисунок 1. UPGMA-дендрограмма генетического сходства исследуемых популяций P. sibirica (А) и популяций P. sylvestris (Б); шкала сверху — генетическое расстояние; на дендрограмме цифрами указаны значения бутстрепа (в %)

На дендрограмме P. sylvestris 1 кластер сформировали выборки Psl_Zc и Psl_Br, а к ним примыкает популяция Psl_Ks (рис. 1Б). О достоверности межкластерных различий можно судить по высокому индексу бутстрепа (>50%) в узлах ветвления.

При выявлении зависимости между генетическими и географическими расстояниями с помощью теста Мантела у P. sibirica был получен высокий коэффициент детерминации (R² = 0,6871), что свидетельствует о высокой корреляции между географическим и генетическим расстояниями у популяций у P. sibirica (Рисунок 2А).

Географическое расстояние (км)

А

Рисунок 2. График зависимости генетических и географических расстояний у изученных популяций: А — P. sibirica ; Б — P. sylvestris

y = 0,0003x + 0,0839

0,037

Географическое расстояние (км)

Б

У P. sylvestris с использованием теста Мантела был выявлен низкий коэффициент детерминации (R ² = 0,0649), что указывает на низкую степень корреляции между географическим и генетическим расстояниями популяций этого вида (Рисунок 2Б).

Заключение

При молекулярно-генетическом анализе у P. sylvestris выявлено 113 ISSR-PCR маркеров, а у P. sibirica меньше — 102 ISSR-PCR маркера. Доля полиморфных локусов незначительно выше у P. sylvestris (P95=0,885) по сравнению с этим показателем у P. sibirica (P95=0,863). Другие показатели генетического разнообразия незначительно выше у P. sibirica (HE=0,195; na=1,330) в сравнении с P. sylvestris (HE=0,166; na=1,212;). Интересен тот факт, что достоверно отличается у двух изученных видов только один показатель генетического разнообразия, а именно — число эффективных аллелей: ne=1,335 у P. sibirica и ne=1,268 у P. sylvestris. Вместе с тем наибольшее число редких аллелей отмечено у P. sylvestris (R=29). Наибольшим генетическим разнообразием характеризуются популяция Ps_Kh у P. sibirica (HE=0,247; na=1,578; ne=1,427) и популяция Psl_Br у P. sylvestris (HE=0,227; na=1,558; ne=1,375), которые рекомендуются для сохранения генетического разнообразия изученных видов на популяционном уровне. Анализ генетической структуры показал, что коэффициенты генетической подразделенности (GST) у двух изученных видов рода Pinus близки и составляют 0,320 у P. sibirica и 0,303 у P. sylvestris. В связи с этим, популяции сосны сибирской и сосны обыкновенной характеризуются средней степенью генетической дифференциации. На наибольшем генетическом расстоянии находятся популяции Ps_Kh и Ps_Bs у P. sibirica и популяции Psl_Ks и Psl_Br у P. sylvestris, а на наименьшем — популяции Ps_Kr и Ps_Bs P. sibirica и популяции Psl_Br и Psl_ Zc у P. sylvestris. Полученные результаты подтверждаются на UPGMA-дендрограммах генетического сходства. С использованием теста Мантела установлено, что между генетическими и географическими расстояниями у популяций P. sibirica степень корреляции высокая (R2 = 0,6871), а у популяций P. sylvestris — низкая (R2 = 0,0649). Результаты данного исследования важны для разработки рекомендаций по сохранению генофондов двух видов рода Pinus в Пермском крае.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Правительства Пермского края в рамках научного проекта №С-26/174.3 от 31.01.2019.