Молочная продуктивность коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета- лактоглобулина

Опыт многих стран с развитым животноводством свидетельствует о важности использования генетических маркеров, которые связанны с качественными признаками молочной продуктивности крупного рогатого скота. В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться гены молочных белков, а именно каппа-казеина и бета-лактоглобулина (Е.С. Усенбеков, 1995; Л.А. Калашникова, 2003; О.В. Костюнина, 2005; Я.А. Хабибрахманова, 2009, О.Г. Зарипов, 2010).

Ген каппа-казеина связан с белковомолочностью и технологическими свойствами молока. Аллель В гена каппа-казеина ассоциирована с более высоким содержанием белка в молоке. Ген бета-лактоглобулина отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока (N. Strzalkowska et al., 2002; Н.А.

Зиновьева и др., 2002). Аллель В гена бета-лактоглобулина связана с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира, тогда как аллель А характеризуется с высоким содержанием сывороточных белков.

В связи с возрастающими требованиями к качеству молока и молочной продукции возникает необходимость использования в селекции генетических маркеров, связанных с признаками молочной продуктивности. В сложившейся ситуации требуется изменение в методах оценки признаков селекции животных. К классическим методам селекции животных необходимо добавить новые подходы, связанные с достижениями генетики и биотехнологии. Одним из современных методов повышения продуктивных качеств животных является маркер-вспомогательная селекция, которая опирается на молекулярногенетические методы анализа, а именно ПЦР-ПДРФ анализ.

Всё выше сказанное говорит о важности изучения молочной продуктивности коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

Материал и методика исследований. Исследования проводились в ООО им. Тукая Балтасинского района РТ на 107 черно-пёстро х голштинских коровах.

Для проведения ДНК-диагностики и оценки по генам каппа-казеину и бета-лактоглобулину у животных были отобраны пробы крови.

Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом: 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Анализ локуса гена каппа-казеина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей 60 мM Трис-HCl (pH 8,5), 1,5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэтанол; 0,1 мМ тритон Х-100; 0,2 мМ дНТФ, 0.5 ед. Taq ДНК полимеразы; по 0,5 мкМ праймеров JK5-hs (состоит из 5/-некомплементарного участка (n) длиной 5 нуклеотидов и 3/-комплементарного участка (N) длиной 25 нуклеотидов (расчетная nN Tm=700C; N Tm =60,80C) и JK3-hs (состоит из 5/-некомплементарного участка (n) длиной 4 нуклеотида и 3/-комплементарного участка (N) длиной 26 нуклеотидов (расчетная nN Tm=73,50C; N Tm=66,70C), сконструированных Р.Р. Вафиным и др. (2007); 1 мкл пробы ДНК, в следующих режимах:

×1: 940С – 4 мин; ×40: 940С – 30 сек, 720С – 30 сек; ×1: 720С – 10 мин,

×1: 940С – 4 мин; ×40: 940С – 10 сек, 680С – 20 сек; ×1: 720С – 5 мин,

• ×1: 94⁰С – 4 мин; ×40: 94⁰С – 10 сек, 72⁰С – 20 сек; ×1: 72⁰С – 5 мин.

Для определения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HinfI в 1×буфере «О» или 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HindIII в ×буфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 370C в течение ночи.

Анализ локуса гена бета-лактоглобулина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl 2 , 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера BLGP3: 5' – GTC CTT GTG CTG GAC ACC GAC TAC A - 3', 0,5 мкМ праймера BLGP4: 5' – CAG GAC ACC GGC TCC CGG TAT ATG A - 3', сконструированных J.F. Medrano и E. Aguilar-Cordova (1990) для амплификации фрагмента гена бета-лактоглобулина длиной 262 пары нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

• ×1:94 ⁰С – 4 мин; ×38:94 ⁰С – 10 сек, 60 ⁰С – 10 сек, 72 ⁰С – 10 сек;

×1:72 0С – 5 мин; хранение: 4 0С.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1×буфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 ⁰С течение ночи.

Идентификация генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина. Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1×ТВЕ буфере. После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм.

Молочную продуктивность определяли ежемесячно путём проведения контрольных доек (ежедекадно). Потом на основании контрольных доек рассчитывали общую молочную продуктивность за 305 дней лактации, а также за укороченную лактацию, но не меньше 240 дней. Содержание жира и белка в молоке определяли на приборе ЛАКТАН 1-4.

В работе наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета хозяйств, то есть племенные карточки (2-МОЛ).

Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel.

Результаты собственных исследований. Для полного анализа молочной продуктивности нами проведены исследования по изучению таких признаков, как продолжительность лактации, удой, содержание, количество жира и белка в молоке, интенсивность молокоотдачи, удой на 1 день лактации коров с разными комбинациями генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

Исследованиями установлено, что наибольшая продолжительность лактации была у коров-первотелок с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АВ и CSN3 АВ / LGB ВВ (298 дн. и 301 дн.), они превосходили коров с другими комбинациями CSN3 / LGB на 2-10 дн (табл. 1).

1. Молочная продуктивность коров с разными генотипами каппа-казеина и бета-лактоглобулина

Показатели	Комбинации генотипов CSN3 / LGB
	АА / АА	АА / АВ	АА / ВВ	АВ / АА	АВ / АВ	АВ / ВВ	ВВ / АВ
n	11	31	26	3	26	7	3
дойных дней	296 ±	296 ±	295 ±	291 ±	298 ±	301 ±	293 ±
	2,9	2,4	2,9	10,7	2,4	3,2	8,7
удой, кг	5278 ±	4968 ±	4860 ±	5422 ±	5346 ±	5044 ±	5162 ±
	282,1	117,0	148,7	313,3	159,5	280,5	377,6
жир, %	4,03 ± 0,06	4,06 ± 0,04	4,04 ± 0,04	4,18 ± 0,08	3,99 ± 0,02	4,02 ± 0,05	3,99 ± 0,10
молочный	212,7 ±	201,7 ±	196,3 ±	226,6 ±	213,3 ±	202,8 ±	206,0 ±
жир, кг	12,25	5,16	5,49	14,93	6,84	10,67	12,40
белок, %	3,18 ±	3,15 ±	3,12 ±	3,26 ±	3,22 ±	3,20 ±	3,31 ±
	0,04	0,02	0,03	0,02	0,02	0,03	0,04
молочный	167,8 ±	156,5 ±	151,6 ±	176,8 ±	172,1 ±	161,4 ±	170,9 ±
белок, кг	9,83	3,96	4,83	11,39	5,94	9,43	14,54
интенсивность	1,67 ±	1,68 ±	1,69 ±	1,94 ±	1,84 ±	1,66 ±	1,76 ±
молокоотдачи, кг/мин.	0,05	0,05	0,04	0,13	0,06	0,07	0,08
удой на 1 день	17,8 ±	16,8 ±	16,5 ±	18,6 ±	17,9 ±	16,8 ±	17,6 ±
лактации, кг	0,92	0,33	0,49	1,29	0,50	0,90	0,81

Наибольший удой за лактацию отмечен в группах животных с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА , CSN3 АВ / LGB АВ и составил 5422 кг и 5346 кг молока, при этом наименьший удой за лактацию был в группах с комбинацией генотипов CSN3 АА / LGB АВ (4968 кг) и CSN3 АА / LGB ВВ (4860 кг). Животные с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА и CSN3 АВ / LGB АВ превосходили сверстниц с другими комбинациями генотипов CSN3 / LGB на 68-562 кг молока. При этом достоверная разница по удою выявлена между сверстницами с комбинацией генотипов CSN3 АА / LGB ВВ и CSN3 АВ / LGB АА – 486 кг (Р<0,05).

По содержанию жира в молоке выгодно отличались животные с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА (4,18%), что выше, чем у первотелок с другими комбинациями генотипов CSN3 / LGB на 0,12-0,19%. При этом достоверная разница по этому показателю была между первотелками с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА и CSN3 АВ / LGB АВ – 0,19% (Р<0,05). Коровы с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА имели также наибольший выход молочного жира (226,6 кг), они превосходили по данному показателю животных с другими комбинациями генотипов CSN3 / LGB на 13,3-30,3 кг.

Первотелки с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА , CSN3 АВ / LGB АВ и CSN3 ВВ / LGB АВ имели наибольшее содержание белка в молоке (3,22-3,31%) и количество молочного белка (170,9-176,8 кг), что выше, чем у животных с другими комбинациями генотипов CSN3 / LGB на 0,02-0,19% и 3,1-25,2 кг соответственно. Причем первотелки с комбинациями генотипов CSN3 АВ / LGB АА , CSN3 АВ / LGB АВ и CSN3 ВВ / LGB АВ достоверно превосходили по содержанию белка в молоке сверстниц с комбинациями генотипов CSN3 АВ / LGB АА и CSN3 АА / LGB ВВ на 0,07-0,19% (Р<0,05-0,001). Тогда как по количеству молочного белка достоверная разница выявлена между животными с комбинациями генотипов CSN3 АВ / LGB АВ и CSN3 АА / LGB ВВ , которая составила 20,5 кг (Р<0,01).

Наибольшие показатели интенсивности молокоотдачи и удоя на 1 день лактации имели коровы с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА (1,94 кг/мин. и 18,6 кг) и CSN3 АВ / LGB АВ (1,84 кг/мин. и 17,9 кг), они превосходили по этим показателям сверстниц с другими комбинациями генотипов на 0,08-0,28 кг/мин. и 0,1-2,1 кг соответственно. При этом первотелки с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АВ достоверно превосходили аналогов, имеющих генотип АА CSN3 на 0,15-0,17 кг/мин. (Р<0,05).

Вывод. Более высокой молочной продуктивностью обладали животные с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА и CSN3 АВ / LGB АВ . При этом наибольшее содержание белка в молоке имели коровы с комбинацией генотипов CSN3 ВВ / LGB АВ .

ЛИТЕРАТУРА: 1. Зарипов, О.Г. Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами ДНК-технологии : автореф. дисс. … канд. биол. наук : 03.01.04 / Зарипов Олег Гаязович. – Казань, 2010. – 24 с. 2. Зиновьева, Н.А. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, Л.К.Эрнст, Г. Брем. – Дубровицы, ВИЖ, 2002. – 112 с. 3. Калашникова, Л. А. Возможности использования ДНК маркеров продуктивных качеств животных в практической селекционной работе / Л.А. Калашникова // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. – Дубровицы, 2003. – С. 33-39. 4. Костюнина, О. В. Молекулярная диагностика генетического полиморфизма основных молочных белков и их связь с технологическими свойствами молока : автореф. дисс. канд. биол. наук : 03.00.23 /Костюнина Ольга Васильевна. – Дубровицы. – 2005. – 21 с. 5. Патент РФ на изобретение № 2299240 Способ проведение ПЦР / Рамиль Р. Вафин, Раиф Р. Вафин, Т.М. Ахметов, Ш.К. Шакиров, Ф.Ф. Замалиева, И.В. Пикалова И.В., Р.Х. Равилов, И.Х. Бакиров. – Приоритет изобретения 21.02.2005. – Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 20.05.2007. – Бюл. № 14.

6. Усенбеков, Е. С. Генотипирование крупного рогатого скота по локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и мутации BLAD : автореф. дисс. канд. биол. наук : 03.00.15 / Усенбеков Есенгали Серикович. – СПб-Пушкин, 1995. – 16 с. 7. Хабибрахманова, Я. М. Полиморфизм молочных белков и гормонов крупного рогатого скота : автореф. дисс.канд.биол.наук : 06.02.01 / Хабибрахманова Язиля Аминовна. – Лесные Поляны. – 2009. – 23 с. 8. Medrano, J. F. Polymerase chain reaction of bovine β -lactoglobuline genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis. / J. F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova // Animal Biotechnology. - 1990. - № 1. - P. 73-77. 9. Strzalkowska, N. Effects of k-casein loci polymorphism, cow`s age, stage of lactation and somatic cell count on daily milk yield and milk composition in Polish Black-and-White cattle / N. Strzalkowska [et al.] // Anim. Science Papers and Reports. – 2002. – V. 20. – № 1. – P. 21-35.

МОЛОЧНАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ КОРОВ С РАЗНЫМИ КОМБИНАЦИЯМИ ГЕНОТИПОВ КАППА-КАЗЕИНА И БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА

Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Валиуллина Э.Ф.

Резюме

В данной работе представлены результаты влияния комбинаций генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина на молочную продуктивность черно-пёстрых голштинских коров. Исследования показали, что наибольшие показатели молочной продуктивности имели коровы с комбинацией генотипов CSN3 АВ / LGB АА и CSN3 АВ / LGB АВ , а более высокую белковомолочность – CSN3 ВВ / LGB АВ .

MILK PRODUCTION OF COWS WITH DIFFERENT COMBINATION GENOTYPES OF KAPPA-CASEIN AND BETA-LACTOGLOBULIN

Ahmetov T.M., Tjulkin S.V., Valiullina E.F.