Морфо-функциональное состояние иммунной системы при ревматических заболеваниях у детей из крупного промышленного центра

Гребенкина Людмила Ивановна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры факультетской педиатрии Яхина Юлия Александровна, старший лаборант кафедры факультетской педиатрии

Антонова Юлия Юрьевна, аспирант

Материалы и методы. Обследовано 219 детей, поступивших в детское кардиоревматоло-гическое отделение Самарского областного клинического кардиологического диспансера за 2002-2006 годы. В исследование включались дети с предварительными диагнозами: ЮИА и ЮСКЛ. Все дети обследовались в течение первых 3-5 дней госпитализации до постановки клинического диагноза и назначения базисной терапии. Распределение обследованных детей по полу и клиническим диагнозам представлено в таблице 1. Контрольную группу составили 22 практически здоровых ребенка (13 девочек и 9 мальчиков) с аналогичным распределением по возрасту и полу.

Всем детям проводилось полное клиническое и лабораторное обследование, принятое в ревматологической клинике. Все данные, полученные в процессе исследования, обработаны стандартными статистическими приложениями "Excel-97". Исследования проводились в иммунологическом отделе ЦНИЛ СамГМУ.

Результаты и обсуждение. Анализ клинических данных обследованных детей выявил некоторые особенности в проявлениях в зависимости от диагноза ЮИА или ЮСКЛ. При ЮИА отмечалась более выраженная лабораторная активность воспалительного процесса, чем при ЮСКЛ, несмотря на большую среднюю длительность заболевания. Вообще, по нашим наблюдениям для современного течения ЮСКЛ является очень характерным прогрессирование заболевания с минимальной активность со стадии дебюта и значительная клинико-лабораторная диссоциация основных проявлений болезни. У детей, больных ЮИА, отмечалась более частая встречаемость поли-артикулярных поражений суставов (78 детей), сопровождающихся существенными рентгенологическими изменениями (II и III стадии) практически у 46% детей этой группы. Кроме этого среди детей больных, ЮСКЛ отмечено наибольшее количество системных проявлений (у 32 детей), а у детей с ЮИА у 14 человек.

Относительные показатели выявления системных проявлений при ЮСКЛ еще более значимые (42,1%), чем при ЮИА (9,8%). Следовательно, развитие системных проявлений у больных ЮСКЛ нельзя объяснить исключительно активностью воспалительного процесса при этом заболевании, скорее всего системные проявления при склеродермии у детей определяются выраженностью иммунопатологических процессов.

Таблица 1. Распределение больных по клиническим диагнозам

Клинический диагноз	Количество больных (n)	Девочки		Мальчики
		n	в %	n	в %
ЮИА	143	84	38,4	59	26,9
ЮСКЛ	76	47	21,5	29	13,2
Всего	219	131	59,9	88	40,1

При анализе состояния иммунной системы у обследованных больных и детей контрольной группы статистически значимых различий в зависимости от пола и возраста детей не выявлено. Индивидуальные колебания абсолютных значений основных популяций лимфоцитов и их субпопуляций не позволяли достоверно оценить функциональное состояние иммунной системы, поэтому при анализе использовались только относительные значения (процентное содержание) тех или иных показателей. При распределении больных по заболеваниям выявлены определенные различия в состоянии иммунной системы, представленные в таблице 2.

Наиболее выраженные отклонения в иммунологическом статусе при ЮИА и ЮСКЛ отмечались со стороны клеточного звена иммунной системы. При этом для ЮИА были характерны следующие изменения: повышение Т-хелперов (CD4+) на фоне существенного дефицита Т-супрессоров (CD8+), значительный подъем иммунорегуляторного индекса, и самое большое количество клеток, несущих рецептор готовности к апоптозу (CD95+). В тоже время у больных этой группы обнаружены умеренные признаки, характеризующие дисбаланс в функционировании гуморального звена иммунной системы: повышение IgM и дефицит системы комплемента. У детей, больных ЮСКЛ отмечались изменения в иммунном статусе в зависимости от наличия или отсутствия системных проявлений. Причем, закономерно были более выражены при системных проявлениях заболевания и сосредоточены исключительно со стороны клеточных показателей функционирования иммунной системы и заключались в более выраженном дисбалансе между хелперной активностью (CD4+) и супрессорной функцией (CD8+) Т-лимфоцитов, что отражается в максимальном повышении ИРИ.

По-видимому, отсутствием сколько-либо значимых изменений со стороны гуморального звена иммунной системы можно объяснить низкую лабораторную активность воспалительного процесса при ЮСКЛ. В тоже время выраженные изме-нения в содержании HLADR-лимфоцитов свидетельствует о значительной активации иммунной системы, особенно при системной форме ЮСКЛ.

Отдельного обсуждения заслуживают результаты исследования количества лимфоцитов, несущих рецептор готовности к апоптозу (CD95+/Fas-антиген). Наибольшие значения экспрессии Fas-антигена отмечались у больных ЮИА, причем для системной формы заболевания они были выше, чем в среднем по группе (77,3 против 71,9). Для группы детей с ЮСКЛ характерна не столь существенно повышенная экспрессия CD95+рецептора. Однако при системных проявлениях ЮСКЛ этот показатель статистически не отличался от группы больных с ЮИА. Вообще была отмечена достаточно высокая положительная корреляционная связь между тяжестью течения ревматологических заболеваний (наличие системных проявлений (r=0,68), количество пораженных суставов (r=0,72), площадью участков склеродермической атрофии кожи (r=0,57) и длительность заболевания (r=0,61) и количеством презентирующих Fas-антиген клеток.

Таблица 2. Изменения иммунологических показателей у детей, больных ЮИА и ЮСКЛ

Показатели	Здоровые дети	Больные ЮИА	Больные ЮСКЛ	Больные ЮСКЛ с системными проявлениями
	n=22	n=143	n=76	n=32
CD3+(%)	69,3+6,21	66,7+8,44	64,2+7,9	61,2+4,6
CD4+(%)	35,1+2,27	59,1+4,92*	54,3+4,63*	58,7+3,96*
CD8+(%)	22,5+2,79	13,9+3,38*	21,2+2,84	11,4+3,18*
CD16+(%)	9,4+2,14	7,8+2,43	8,2+2,28	9,1+2,63
CD19+(%)	13,4+2,86	17,8+3,12	15,1+2,65	14,7+2,58
CD95+(%)	27,5+4,31	71,9+6,54*	51,3+5,26*	69,3+7,64*
HLA-DR+(%)	12,1+2,47	16,1+3,71	15,4+3,22	19,7+3,46*
ИРИ (CD4+/CD8+)	1,6+0,32	4,3+1,08*	2,56+0,48*	5,16+0,82*
IgG (г/л)	11,8+3,24	16,7+3,82	14,6+2,76	13,2+2,76
IgM (г/л)	2,2+0,38	4,4+0,44*	2,9+0,61	3,2+0,83
ЦИК (ед)	96,3+4,8	98,6+5,2	99,2+5,12	94,2+4,26
Комплемент титр (ед)	59,6+5,7	42,6+4,2*	58,3+4,2	57,4+6,1
Фагоцитарный индекс	6,2+0,9	5,9+1,1	5,6+0,82	5,5+0,67

Примечание. * - статистически достоверные различия с контролем при р<0,05.

Достаточно важным является вопрос о том, какие субпопуляции лимфоцитов вносят наибольший вклад в повышенную экспрессию CD95+ при различных ревматических заболеваниях. Для решения данной задачи была построена корреляционная матрица с использованием R-коэффициента корреляции Спирмэ-на, показывающая связь между процентным содержание CD95+лимфоцитов и остальными субпопуляциями лимфоцитов у обследованных детей. У здоровых детей умеренная степень взаимосвязи между презентацией CD95+ и CD3+ и CD4+ лимфоцитами показывает, что происходит нормальный процесс формирования антигенспецифичных Т-клеток и их окончательного дифференцирования. В тоже время при исследуемых заболеваниях у детей отмечаются существенные различия в корреляционных взаимосвязях субпопуляций лимфоцитов и экспрессией FAS-антигена, которые могут отражать определенную направленность патогенетических механизмов формирования заболеваний. При ЮИА и ЮСКЛ отмечается достаточно высокая положительная взаимосвязь между экспрессией CD95+ и CD8+ лимфоцитами, а также умеренная степень корреляции с HLA-DR+ лимфоцитами, что происходит на фоне высокой отрицательной зависимости CD95+ и CD4+лимфоцитов. Такие результаты корреляционного анализа можно рассматривать как проявление достаточно серьезного Т-супрессорного дефицита, связанного с их выраженной апоптической гибелью и элиминацией из периферической крови. Выраженная отрицательная взаимосвязь между CD95+ и Т-лимфоцитами-хелперами свидетельствует о нарушении апоптического процесса со стороны Т-хелперов, приводящего к избыточной циркуляции этих клеток, сопровождающейся длительной чрезмерной стимуляции других субпопуляций лимфоцитов, что подтверждается повышением количества HLA-DR+лимфоцитов. Данные результаты подтверждают основные положения патогенеза ЮИА и ЮСКЛ, рассматриваемые как количественный и/или качественный дефицит Т-супрессорной активности лимфоцитов и позволяют предположить, что в основе этого лежит нарушение процессов апоптоза различных субпопуляций лимфоцитов.

Выявленные изменения в функциональном состоянии иммунной системы подтвердились при изучении цитоморфометрических показателей лимфоцитов периферической крови у обследованных детей. Цитоморфометрия лимфоцитов была проведены у 20 детей каждой группы (здоровые, больные ЮРА, больные ЮСКЛ и больные ЮСКЛ с системными проявлениями). Данные цитоморфометрических исследований лимфоцитов приведены в таблице 3. Средние морфометрические показатели лимфоцитов у больных всех групп претерпевали значительные изменения по сравнению с нормой. Размер цитоплазмы лимфоцитов был в 1,2-1,5 раза меньше, а цитоплазменноядерное отношение в 1,2 раза.

Таблица 3. Средние цитоморфометрические показатели лимфоцитов крови детей, больных ЮИА и ЮСКЛ

Показатель	Котроль-ная группа	ЮИА	ЮСКЛ	ЮСКЛ с системными проявлениями
средний размер клетки, мкм	8,52 ± 0,22	7,16 ± 0,37*	6,39 ± 0,44*	5,96 ± 0,42*
средний размер ядра, мкм	5,87 ± 0,18	5,12 ± 0,26*	4,83 ± 0,31*	4,66 ± 0,36*
цитоплазменно-ядерное отношение	0,45 ± 0,06	0,38 ± 0,04	0,34 ± 0,07	0,27 ± 0,08*

Примечание: * - статистически достоверные различия с контролем при р<0,05

Важно отметить, что уменьшение средних размеров лимфоцитов в обеих группах в большей степени происходило за счет размеров цитоплазмы. Встает вопрос, за счет чего происходит уменьшение средних цитоморфомет-рических показателей иммунокомпетентных клеток при ревматических процессах. Согласно литературным данным, Т-клетки-супрессоры крупные. Они имеют высокое цитоплазменноядерное отношение, а Т-хелперы небольшого размера (значительно меньше, чем Т-супрес-соры), имеют низкое цитоплазменно-ядерное отношение. Можно предположить, что значительное снижение средних цитоморфометриче-ских показателей лимфоцитов у детей, больных ЮИА и ЮСКЛ, объясняется преобладанием клеток с небольшими размерами ядра и цитоплазмы (CD4+) и уменьшением числа “крупных”

клеток (CD8+). Следовательно, цитоморфометрические исследования косвенно подтверждают данные определения клеточных маркеров лимфоцитов при ЮИА и ЮСКЛ, что нарушение процессов апоптоза приводит к нарушению иммуносупроссорной функции цитотоксических лимфоцитов (CD8+) и способствует безконтрольному функционированию Т-хелперов, обеспечивающих поддержание аутоиммунных процессов.

М ы исследовали содержание цитокинов в сыворотке крови у 36 детей, больных ЮРА, и у 32 детей, больных ЮСКЛ (в том числе у 14 с системными проявлениями). Средние значения концентрации цитокинов в сыворотке крови представлены в табл. 4.

Таблица 4. Содержание цитокинов в сыворотке крови у детей, больных ЮИА и ЮСКЛ

Параметры (нг/мл)	здоровые	ЮИА	ЮСКЛ	ЮСКЛ системная
ФНО	43,2+0,23	73,4+0,35*	56,7+0,08*	69,7+0,39*
ИНФ-g	47,6+0,34	108,4+0,44*	112,7+0,12*	128,2+0,42*
ИЛ-4	45,5+0,04	47,6+0,32*	46,1+0,28*	47,9+0,02*
ИЛ-8	19,8+0,45	38,4+0,07*	29,6+0,44*	37,7+0,11*

Примечание: * - статистически достоверные различия с контролем при р<0,05.

Результаты анализа содержания цитокинов у больных ЮИА и ЮСКЛ показывают принципиальные отличия в регуляции иммунного ответа при этих заболеваниях у детей. Наиболее значимые различия отмечаются в содержании ФНО-а, что объясняет отличие в показателях лабораторной активности при ЮИА и ЮСКЛ. Известно, что ФНО-а является ключевым цитокином, определяющим выработку таких острофазовых маркеров воспаления, как СРБ, серомукоид и др. Поэтому двухкратное повышение у больных ФНО-а при ЮИА и при ЮСКЛ системном варианте и тенденция к нарастанию значений этого цитокина при ЮСКЛ очаговой формы являются важным моментом в иммунопатогенетическом объяснении различий в лабораторной активности при двух ревматических заболеваниях у детей. Эти различия могут достаточно четко прояснить отсутствие эффекта при лечении ЮСКЛ очаговой формы нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП). Фактически нормальный уровень ФНО-а при ЮСКЛ лишает НПВП одной из точек приложения этих препаратов.

Достаточно несущественные различия отмечены в содержании ИЛ-4 при ЮИА и ЮСКЛ, которые свидетельствуют о том, что при ЮИА идет активация как клеточного — Th1-зависимого (повышение y -ИНФ), так и гуморального — Th2-зависимого (повышение Иё-4) иммунного ответа. При ЮСКЛ практически происходит активация только клеточного (резкое повышение y -ИНФ) звена иммунной системы, причем более выраженное при системных проявлениях ЮСКЛ. Присутствие ярко выраженной зависимости содержания ИЛ-8 в крови от клинических проявлений при ЮИА скорее всего объясняется тем, что данный цитокин определяет не только местные иммунные реакции. Следовательно, повышения ИЛ-8 возможно ожидать в синовиальной жидкости или в сыворотке крови при выраженных системных проявлениях заболеваний, что отмечается при системной форме ЮСКЛ.

Выводы:

• 1.    Выявлены единообразные изменения в функционировании иммунной системы у детей, страдающих ЮИА и ЮСКЛ.

• 2.    Определяющим моментом в формировании аутоиммунных реакций при ЮИА и ЮСКЛ у детей является разнонаправленные изменения процесса апоптоза основных субпопуляций лимфоцитов, определяемые по цито-морфометрическим показателям и содержанию лимфоцитов несущих рецептор CD95+.

• 3.    Изменения цитокинового профиля у детей, больных ЮИА и ЮСКЛ подтверждают аутоиммунный характер воспаления и в тоже время выявляют существенные различия в механизмах, лежащих в основе формирования патогенетических особенностей каждого заболевания.