Морфофункциональная динамика гипофарингеальных желёз рабочих пчёл при переходе к активному сезону

Изучение временных закономерностей гипофарингеальных желез имеет практическое значение для разработки оптимальных графиков подкормки и ветеринарно -технологических мероприятий, направленных на повышение продуктивности и устойчивости семей в разные периоды сезона [3, 4].

Несмотря на имеющиеся исследования, описывающие общие тенденции сезонной активности гипофарингеальных желез у различных таксонов пчел рода Apis в разных климатических зонах, количественные характеристики динамики морфометрических показателей среднерусской породы пчел в конкретные фиксированные сроки после выхода из зимовки изучены недостаточно [5, 6]. В литературе часто описываются отдельные наблюдения или даются качественные характеристики, тогда как систематическое количественное сопоставление динамики числа альвеол, линейных размеров и диаметра выводного протока с интегральной оценкой степени развития желёз на одних и тех же выборках в разные периоды проводится редко. Кроме того, не всегда учитывается влияние организационно -технологических условий содержания (однородность ульев, режим подкормки, отбор проб из разных семей) на воспроизводимость морфометрических данных, что затрудняет практическое применение результатов на пасеках [7, 8, 9].

Научная новизна данной работы заключается в проведении комплексного количественного анализа сезонной динамики гипофарингеальных желез рабочих пчел среднерусской породы в пять строго фиксированных сроков после выхода из зимовки (с 20 марта по 15 июня) с применением стандартизированной методики отбора проб, морфометрии и интегральной балльной оценки развития желез. Полученные данные позволяют оптимизировать сроки и состав подкормок, ветеринарнотехнологические мероприятия и мониторинг готовности семей к интенсивному выращиванию расплода — в частности, указывают на критический период активизации желез в интервале с 20 марта по 12 апреля и необходимость усиленной поддержки семей в этот период.

Гипофарингеальная железа у рабочих пчел она состоит из множества мелких трубочек, заканчивающихся альвеолами — маленькими овально-мешковидными структурами, образованными секреторными клетками. Альвеолы имеют тонкие выводные протоки, через которые секрет попадает в ротовую полость пчелы. Морфологически альвеолы являются элементарными структурными единицами секреторных отделов железы формирующих ее паренхиму. Ацинус – это более крупная структурная единица, которая объединяет несколько альвеол, имеющих общий выводной проток, представлен на рисунках 1-4 [10].

Рисунок 1 - Правая половина глоточной железы. Окраска азаном по Гейденгайну.

Ув. 120.

Рисунок 2 - Альвеолы - маленькие овально-мешковидные структуры.

Ув. 180.

Рисунок 3 - Объединение альвеол в ацинусы.

Ув.200

Рисунок 4 - Ацинусы. Ув. 300.

Цель исследования — количественная оценка сезонной динамики морфофункционального состояния гипофарингеальных желез рабочих пчел ( Apis mellifera L ., среднерусская порода) в весенний период с 20 марта по 15 июня, с помощью последовательной морфометрии и интегральной балльной оценки.

Условия, материалы и методы. В соответствии с поставленной целей проведено морфоцитологическое исследование гипофарингеальных желёз рабочих пчёл весенней генерации среднерусской пород, включающее анализ гистологической структуры и ультраструктуры. Пробы отбирали в пять строго фиксированных сроков: 20 марта (исходная группа, перезимовавшие пчёлы), 12 апреля, 3 мая, 24 мая и 15 июня 2023 и 2024 годов.

Исследования выполнялись на кафедре частной зоотехнии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, пробы отбирались на пасеках Бирского района Республики Башкортостан, электронная микроскопия проводилась в Российском центре глазной и пластической хирургии (г. Уфа).

Образцы отбирали из семей с 9–10 улочками и матками в возрасте 1,5 года. Весенний генерацию в ульях было по 7-8 кг кормового меда. Каждая проба состояла из 36 пчел и делилась на две равные группы по 18 особей. Первая группа подвергалась щелочной диссоциации для подсчета альвеол, вторая — использовалась для морфологических и уль-траструктурных исследований.

Для световой морфологии использовали полутонкие срезы ультратома, окрашенные эозином и метиленовым синим, а также парафиновые срезы, обработанные гематоксилином и эозином, азуром II с эозином. Количество и площадь ацинусов, а также соотношение соединительной ткани и паренхимы определяли с помощью окулярной сетки по методике Г.Г. Автандилова (1973), полученные количественные данные приводились в процентах [10, 11].

Для электронной микроскопии головы пчел (рис. 5-8) разрезали на фрагменты площадью примерно 1 мм2 и фиксировали в 2% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере Миллонига (pH 7,2–7,4) в течение 2 часов, затем трижды промывали тем же буфером и дополнительно фиксировали в 1% растворе тетроксида осмия на аналогичном буфе- ре в течение 1 часа. Образцы обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и в абсолютном ацетоне, затем заливали в эпон-812 по стандартной методике. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB-III (Швеция), контрастировали 2% раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу и фотографировали в электронном микроскопе Jem-1011 (Jeol, Япония) при увеличении 2500–25000 в Российском центре глазной и пластической хирургии в лаборатории морфологии (г. Уфа).

Рисунок 5 - Ультраструктура секреторной клетки ацинуса гипофарингеальной железы рабочей пчелы в конце зимовки.

Рисунок 6 - Ультраструктура секреторной клетки ацинуса гипофарингеальной железы рабочей пчелы в конце зимовки.

В рисунке 5 и 6 показано ультраструктур-ная организация секреторной клетки рабочей пчелы в конце зимовки. Срез секреторной клетки ацинуса, в которой преобладает крупное ядро (Я) с выраженной зональной структурой хроматина, содержит в основном эухро-матин, но с локальными плотными участками (УХ). Такое распределение указывает на пониженный, остаточный уровень транскрипционной активности, часть генетического материала «конденсирована» и недоступна для интенсивного транскрибирования.

Кариолемма (К) четко просматривается, без явных крупноочаговых разрывов на данном участке изображения. Гранулярная эндоплазматическая сеть (ГЭС) представлена цистернами и пучками мембран с прикрепленными рибосомами, но их плотность и выраженность снижены по сравнению с активным секреторным состоянием - это отражает ослабление белоксинтетической функции. Везикулы (В) и зрелые секреторные везикулы (ЗСВ) в цитоплазме присутствуют отдельные везикулы различной электронной плотности, однако их количество невелико по сравнению с периодом высокой секреторной активности. На рисунке 6 показан участок цитоплазмы секреторной клетки с выраженной вакуолизацией и многочисленными мембранными структурами, часть из которых разрушается. На снимке присутствуют как элементы гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС), так и агранулярного (АЭС). АЭС выглядит как скопление мембранных цистерн без рибосом, отдельные участки эндоплазматической сети вакуолизированы и фрагментированы. Это свидетельствует о нарушении и начале деградации синтетической функции клетки. Встречаются везикулы и зрелые везикулы, часть из них может иметь разную электронную плотность - это остаточные и частично деградировавшие секреторные структуры.

Присутствуют округлые мембранные структуры с электронно-плотным содержимым - аутофагосомы и лизосомоподобные тельца. Они указывают на активные процессы аутофасом, т.е лизосомальной деградации внутриклеточных компонентов. Часто видны слипшиеся клетки и остаточные тельца.

По периферии клетки отмечены локальные разрывы плазматической мембраны и мелкие пузырьки (на изображении обозначены стрелками).

Выраженная вакуолизация цитоплазмы -большие пространства (вакуоли) с различным содержимым, что характерно для деградации органелл и накопления продуктов распада.

Оба изображения демонстрируют морфологию секреторной клетки в состоянии пониженной функциональной активности и активной переработки внутриклеточных компонентов в конце зимовки. Подчеркивает снижение транскрипционно-синтетической активности (уплотнение хроматина, уменьшение размеров ГЭС и количества секреторных элементов).

На рисунке 7 и 8 показаны ультраструк-турная организация секреторной клетки ацинуса гипофарингеальной железы рабочей пчелы весенней генерации. Секреторная клетка с непрерывным циклом секреции компонентов маточного молочка, видно активное формирование, созревание и экзоцитоз секреторных гранул. Показано существенное увеличение и накопление, зрелые секреторные везикулы (ЗСВ), зрелых электронно-плотных секреторных гранул (ЭПСГ) различной величины, преимущественно в апикальной зоне цитоплазмы.

ВЕТЕРИНАРИЯ

Рисунок 7 - Ультраструктурная организация секреторной клетки ацинуса гипофарингеальной железы пчелы весенний группы.

Рисунок 8 - Ультраструктурная организация секреторной клетки ацинуса гипофарингеальной железы пчелы весенний группы.

Интегральная оценка развитости для суммарной характеристики состояния железы применяли балльную шкалу развитости по методике Гесса: 1 — выраженная атрофия; 2 — слабая развитость; 3 — средняя развитость; 4 — высокая развитость. Баллы присваивали слепым образом по заранее описанным морфологическим критериям (размер альвеол, плотность расположения, выраженность секреторного эпителия и диаметр протока). Все оценки выполнялись двумя независимыми экспертами, при расхождении менее 10% проводилось повторное обсуждение и пересмотр.

Обработку данных проводили с применением стандартного пакета для статистического анализа. Для каждой группы рассчитывали среднее (M) и стандартную ошибку среднего (m), а также коэффициент вариации (Cv, %).

Уровни статистической значимости задавались как: р ≥ 0,99, - высоко значимо; р≥0,999 -крайне значимо.

Результаты и обсуждение. В таблице представлены динамические изменения морфометрических показателей альвеол гипофарингеальной (глоточной) железы рабочих пчёл среднерусской породы в последовательные весенне-летние сроки: 20 марта (перезимовавшие), 12 апреля, 3 мая, 24 мая и 15 июня. В исходной группе перезимовавших пчёл (20 марта) среднее число альвеол на единицу составило 115,60 шт., длина секреторной клетки ацинуса — 144,28 мкм, ширина секреторной клетки ацинуса — 138,44 мкм, диаметр выводного протока — 6,52 мкм, степень развитости — 2,90 балла.

Таблица – Динамика гипофарингеальных желез у 9-ти суточных рабочих пчёл после зимовки

Альвеолы железы: показатели	Стат. показатель	Сроки
		20 марта перезимовавшие (n=18)	12 апре ля (n=18)	03 мая (n=18)	24 мая (n=18)	15 июня (n=18 )
Количество альвеол, шт.	М	115,60	185,28***	208,32***	218,48***	246,52***
	±m	0,76	1,82	0,79	2,02	1,74
	Cv, %	0,66	0,98	0,38	0,92	0,71
Длина секреторной клетки ацинуса, мкм	М	144,28	219,72***	220,12***	226,80***	230,32***
	±m	1,02	1,51	2,06	1,18	1,22
	Cv, %	0,71	0,69	0,94	0,52	0,53
Ширина секреторной клетки ацинуса, мкм	М	138,44	187,12***	186,88***	188,32***	189,68***
	±m	1,51	1,32	2,22	1,98	1,62
	Cv, %	1,09	0,71	1,19	1,05	0,85
Диаметр выводного протока, мкм	М	6,52	7,12**	8,20***	8,96***	9,26***
	±m	0,18	0,13	0,15	0,23	0,22
	Cv, %	2,76	1,83	1,83	2,57	2,48
Степень развитости, балл	М	2,90	3,72***	3,78***	3,87***	3,94***
	±m	0,06	0,04	0,03	0,02	0,02
	Cv, %	2,07	1,08	0,79	0,52	0,51

Примечание: *** -р>0,999; ** - р>0,99, по сравнению перезимовавший группой пчел

В период после выхода из зимовки наблюдался устойчивый и выраженный рост всех исследованных показателей. Уже к 12 апреля среднее количество альвеол увеличилось до 185,28, при этом статистически значимое отличие от показателей перезимовавшей группы было крайне выраженным (р≥0,999). Аналогичным образом отмечался резкий прирост длины секреторной клетки ацинуса ‒ 219,72 мкм, ее ширины ‒ 187,12 мкм, диаметра выводного протока ‒7,12 мкм (р≥0,99) и степени развития ‒ 3,72 балла. В последующие сроки 3 мая, 24 мая и 15 июня все показатели продолжали расти: количество альвеол — 208,32 → 218,48 → 246,52 шт.; средняя длина секреторной клетки ацинуса — 220,12 →226,80 →230,32 мкм; ширина клеток — 186,88 →188,32 →189,68 мкм; диаметр выводного протока — 8,20 →8,96 →9,26 мкм; интегральный балл развитости — 3,78 →3,87 →3,94. В большинстве сравнений с исходной (перезимовавшей) группой различия были статистически высоко значимы (р≥0,999). В целом полученные данные свидетельствуют о непрерывном восстановлении и дальнейшем укреплении секреторного аппарата гипофарингеальной железы после зимовки.

Наиболее интенсивная перестройка наблюдается в ранневесенний период, с 20 марта по 12 апреля, что свидетельствует о быстром переходе от состояния относительной атрофии к активной секреторной функции при улучшении внешних условий и возрастании потребности в кормлении расплода. Рост количества альвеол со 115,60 до 246,52 к 15 июня свидетельствует не только о гипертрофии отдельных секреторных клеток, но и об организационном увеличении общей секреторной площади железы. Одновременное увеличение длины и ширины секреторной клетки ацинуса альвеол показывает, что рост происходит и по продольному, и по поперечному измерению, то есть альвеолы увеличиваются в объёме, что коррелирует с повышением синтетической способности железы.

Увеличение диаметра выводного протока с 6,52 до 9,26 мкм указывает на морфологиче- скую адаптацию, облегчающую транспорт и выделение секрета при возрастающей секреции. Значимость прироста уже к 12 апреля (р≥0,99) показывает, что изменения протоковой системы начинается одновременно с ростом ацинусов.

Рост интегрального балла развитости от 2,90 до 3,94 отражает суммарное улучшение морфофункционального состояния железы. Низкие коэффициенты вариации по всем точкам указывают на высокую однородность выборки и воспроизводимость эффекта.

Быстрая реакция желез в апреле-мае согласуется с биологическими потребностями пчелиной семьи.

С началом выращивания расплода и увеличением потребности в маточном молочке гипофарингеальные клетки испытывают повышенную функциональную нагрузку, что приводит к быстрому увеличению количества и объема альвеол. Полученные данные соответствуют типичной сезонной динамике развития рабочих пчел при переходе от зимнего состояния к активному рабочему периоду. Уровни значимости р≥0,999 и р≥0,99 подтверждают высокую статистическую значимость отличий по сравнению с группой пчел, переживших зиму. Это свидетельствует о достоверности зарегистрированных изменений и их характерности для исследуемой популяции при данных условиях содержания и кормления.

Вывод. В период с марта по июнь (весна– лето) гипофарингеальные железы рабочих пчел среднерусской породы заметно восстанавливаются, и их морфологическая и функциональная структура продолжает формироваться. Наиболее интенсивные изменения происходят ранней весной (в апреле), что отражает физиологическую адаптацию семьи к возрастающей потребности в секрете для выращивания расплода. Высокие показатели и их статистическая значимость подчеркивают необходимость регулярного контроля состояния гипофарингеальных желез при оценке готовности пчелиных семей к наиболее активному летнему сезону.