Морфофункциональная характеристика моноцитов периферической крови и их предшественников у потомства самок крыс с аутоиммунным поражением печени

Актуальность настоящего исследования определяется необходимостью воспроизводства полноценного поколения. В последние годы отмечен рост числа бесплодных браков и рождение детей с различными патологиями. Наряду со многими причинами нарушения внутриутробного развития плода ведущая роль принадлежит экстрагенитальной патологии со стороны материнского организма, приводящая к ухудшению условий антенатального развития и, как следствие, перинатальной патологии плода. Заболевания гепатобилиарной системы как проявление экстрагенитальной патологии матери во время беременности осложняют течение самой беременности и увеличивают вероятность прогностически неблагоприятного исхода для потомства. Многочисленные экспериментальные и клинические исследования, проведенные сотрудника ми нашей кафедры, указывают на нарушения становления систем жизнеобеспечения у потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы, в том числе репродуктивной [6, 14, 16], иммунной [19], макрофагальной [1], эндокринной [116 17], пищеварительной [15] и др. Большинство фундаментальных процессов, находящихся в основе индивидуального развития, в настоящее время изучены недостаточно. В частности, под пристальным вниманием российских и зарубежных ученых находятся вопросы становления одной из важнейших систем человеческого организма - системы крови. Ранее сотрудниками кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ЮУГМУ в условиях эксперимента было установлено, что у самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы рождается потомство с нарушениями морфофункционального состояния моноцитов костного мозга и периферической крови [4, 5]. Неоспоримым фактом является положение о том, что резистентность любого живого организма во многом определяется состоянием ряда систем жизнеобеспечения, в том числе системы неспецифической защиты, основными агентами которой являются макрофаги [10]. Кроме того, данные клетки во многом определяют характер и интенсивность иммунологической реактивности организма [10]. Нарушение дифференцировки клеток моноцитарного ростка ведет к снижению и потере неспецифической резистентности организма.

Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явился анализ роли хронического поражения печени в нарушении морфофункционального становления клеток моноцитарного ростка костного мозга и моноцитов периферической крови у потомства.

Материалы и методы. Экспериментальное исследование было проведено на белых лабораторных крысах «Вистар» и их потомстве в различные периоды постнатального онтогенеза - на 30-й и 60-й день. Сроки проведения эксперимента были выбраны с учетом общепринятого подразделения возрастных периодов у крыс [13]. Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием животных», утвержденными приказом М3 СССР № 755 от 12.08.77. Исследования проводились с учетом суточных колебаний. Животные исследуемых групп содержались в виварии в одинаковых условиях. Все животные были разделены на 2 группы. В первую группу выделено потомство от интактных крыс (контрольная группа - К) -42 животных из 12 пометов, во вторую группу (опытная группа О) включены были крысята от самок крыс с экспериментальным поражением печени -38 животных из 10 пометов. Для достижения поставленной цели исследования у подопытных животных моделировалось аутоиммунное поражение печени с помощью вакцины БЦЖ, путем подкожной иммунизации, с чередованием внутрибрюшинного введения печеночного антигена с интервалом в три дня.

В качестве объекта исследования изучались клетки моноцитарного ростка: монобласты, промоноциты, моноциты костного мозга и моноциты периферической крови. Выделение клеток костного мозга проводили по об- щепринятой методике [11]. Красный костный мозг получали из отпрепарированной от мышц бедренной кости забитого животного с отсеченными эпифизами путем выдавливания. Из полученного костного мозга изготавливали мазки. Моноциты периферической крови выделяли с помощью метода, основанного на седиментации их в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3) [20]. Метод получения монослоя клеток основан на способности мононуклеаров адгезироваться на чистой стеклянной поверхности [22]. Исследования проводили в мазках и в монослое клеток [9].

Количественный состав клеток производили в камере Горяева. Функциональное состояние клеток оценивали с помощью цитохимических методов исследования.

В мазках изучалась способность клеток к накоплению гликогена. С этой целью проводилась ШИК-реакция по Мак-Манусу, основанная на способности йодной кислоты окислять спиртовые группы, что при взаимодействии с реактивом Шиффа (фуксин - сернистая кислота) приводит к образованию кислотностойкого красителя красно-фиолетового цвета. ШИК-положительные вещества окрашиваются в красный цвет различных оттенков. Нейтральные мукополисахариды, содержащие гексозу - пурпурно-красные, гликоген - темнокрасный [3].

Количество накопленного клетками гликогена визуально оценивали полуколичест-венным методом с вычислением среднего цитохимического коэффициента по формуле Астальди и Верга (1957).

Активность кислой фосфатазы изучали с помощью реакции азосочетания. Альфа-глицерофосфатдегидрогеназу определяли по методу [8]. В результате реакции места размещения фермента выявляются по восстановлению тетразолия до формазанов, окрашенных в фиолетовый цвет.

Полученные цифровые данные обрабатывали на компьютере с использованием программы SPSS Statistics 17,0 (StatSoft, Inc.) Учитывая небольшую выборку животных, достоверность полученных результатов определяли при помощи непараметрического метода -критерия Манна-Уитни.

Результаты собственных исследований.

Проводилось определение содержания клеток моноцитарного ростка костного мозга и моноцитов периферической крови. Полученные результаты отражены в табл. 1.

Таблица 1

Table 1

Содержание клеток моноцитарного ростка костного мозга и моноцитов периферической крови у потомства самок крыс с аутоиммунным поражением печени в различные сроки постнатального онтогенеза (х 105в1 мл)

Count of bone marrow monocyte lineage and peripheral blood monocytes in progeny of female rats with autoimmune liver injury at different stages of postnatal ontogenesis (x 10° per 1 ml)

Группа Group	Монобласты Monoblasts		Промоноциты Promonocytes		Моноциты КМ Bone marrow monocyte		Моноциты ПК Peripheral blood monocytes
	30-й день Day 30	60-й день Day 60	30-й день Day 30	60-й день Day 60	30-й день Day 30	60-й день Day 60	30-й день Day 30	60-й день Day 60
Контроль Control	0,72 (0,5-1,0)	1,02 (0.25-1,2)	1,5 (1,25-1,75)	1,74 (1,5-2,0)	3,28 (2,5-4,0)	3,27 (2,75-3,75)	3,4 (2,25-4,0)	3,32 (2,75-4,0)
Опыт Experimental	0,47 (0,25-0,75)	0,27 (0,25-0,5)	1,02 (0,75-1,25)	0,65* (0,5-0,75)	2 3 (2,0-2,5)	1,75* (1,5-2,0)	2,22 (2,0-2,5)	1,6* (1,5-1,75)

Примечание: * - 95 % ДИ.

Note: * - 95 % confidence interval.

В результате проведенного исследования у подопытных крысят на 30-й день постнатального развития было выявлена тенденция к уменьшению содержания в 1 мл взвеси клеток как незрелых клеток моноцитарного ростка -монобластов и промоноцитов, так и зрелых форм - моноцитов, что может указывать на возможное нарушение процессов дифференцировки моноцитов в костном мозге.

Подобная динамика наблюдается и в отношении моноцитов периферической крови -изменение содержания в 1 мл моноцитов периферической крови в опытной группе на 30-й день постнатального развития по сравнению с контролем. На 60-й день развития у крысят матерей опытной группы наблюдалось достоверное изменение количества всех клеток моноцитарного ростка - монобластов и промоноцитов по сравнению с контролем соответственно. В отношении зрелых форм наблюдается снижение количества моноцитов опытной группы по сравнению с контрольными животными. В то же время можно отметить уменьшение количества клеток моноцитарного ростка - монобластов и промоноцитов у 60-дневных крысят по сравнению с 30дневными в опытной группе животных, соответственно. В группе контрольных животных на 60-й день постнатального развития происходит закономерное увеличение содержания в 1 мл и клеток моноцитарного ростка, и зрелых форм моноцитов костного мозга и периферической крови, в сравнении с 30-дневным сроком. Обращает на себя внимание факт существенного различия количества моноцитов в костном мозге и моноцитов периферической крови. Наблюдается заметное уменьшение содержания в 1 мл моноцитов периферической крови в опытных группах 30-дневных и 60-дневных крысят, тогда как в контрольных группах мы видим закономерное увеличение количества моноцитов периферической крови 30-дневных и 60-дневных крысят, в сравнении с количеством в 1 мл моноцитов костного мозга тех же сроков соответственно.

Снижение количества моноцитов периферической крови опытных групп может быть вызвано либо нарушением процессов моноци-топоэза в костном мозге, либо массовой миграцией моноцитов в очаг воспаления в тканях.

В ходе изучения количественного соотношения клеток моноцитарного ростка костного мозга мы выявили тенденцию к снижению абсолютного количества клеток на всех стадиях развития в экспериментальной группе животных по сравнению с контролем, что связано с нарушением процесса моноцитопо-эза в красном костном мозге вследствие негативного влияния хронического поражения печени матери на гемопоэз потомства.

В следующей серии исследований была проведена оценка способности моноцитов различных стадий дифференцировки к накоплению гранул гликогена. Результаты исследования монобластов, промоноцитов моноцитов костного мозга представлены в табл. 2.

Из таблицы видно, что количество ТТТИК-позитивных незрелых клеток моноцитарного ростка костного мозга - монобластов и промоноцитов снижено в опытной группе по сравнению с контролем, соответственно на ЗО-й день постнатального развития.

Подобная закономерность наблюдается и в группе опыта и контроля на 60-й день развития. Такая же картина выявлена в отношении зрелых форм моноцитов периферической крови экспериментальных животных в сравнении с контрольной группой.

Обращает на себя внимание факт незначительного увеличения количества ТТТИК-позитивных клеток незрелых форм моноцитарного ростка - монобластов и промоноцитов на 60-й день постнатального развития в опытной группе по сравнению с 30-дневным сроком соответственно. Тогда как в контрольной группе животных, на этих же сроках, отмечается более интенсивное увеличение количества (ПИК-позитивных незрелых клеток моноцитарного ростка костного мозга. В отношении зрелых форм моноцитов костного мозга и периферической крови картина будет выглядеть иначе. Здесь мы четко прослеживаем тенденцию увеличения количества ТТТИК - позитивных клеток моноцитов костного мозга и периферической крови на сроке 60 суток по сравнению с 30-дневным сроком как в опытной, так и в контрольной группах животных. Можно отметить, что разница между контролем и опытом по мере повышения степени дифференцировки клеток увеличивается, что можно объяснить тем обстоятельством, что чем более зрелым становится моноцит, тем сильнее у него способность к запасанию питательных веществ, в частности, гликогена [2]. Что является необходимым ус- ловием для выполнения основных функций моноцита, в том числе фагоцитарной и кил-линговой [18].

Реализация защитных воспалительных функций полиморфноядерных лейкоцитов обусловлена мобилизацией внутриклеточных гранул. Экзоцитоз гранул крайне важен, так как именно он ответственен за появление лейкоцитов в очаге воспаления с развитием последующих защитных реакций. Одним из маркеров первичных (азурофильных) гранул служит кислая фосфатаза. Этот фермент вовлечен в регуляцию биологических процессов на разных уровнях. С его действием связано начало и осуществление многих биохимических процессов.

Учитывая, что кислая фосфатаза является маркером лизосомального аппарата, следующим этапом работы было изучение влияния патологии матери на активность кислой фосфатазы в моноцитарных клетках потомства. Исследование показало угнетение данного показателя в опытной группе по сравнению с контролем.

Обращает на себя внимание наименьшая активность кислой фосфатазы в незрелых клетках моноцитарного ростка - монобластах, во всех исследуемых группах животных. По мере созревания моноцитов этот показатель увеличивается, достигая наибольших значений в зрелых формах исследуемых клеток периферической крови. Причем, на сроке 60 суток активность кислой фосфатазы выше, чем у 30-дневного потомства во всех рассматриваемых группах животных.

Таблица 2

Table 2

Содержание ШИК-позитивных клеток моноцитарного ростка костного мозга и моноцитов периферической крови у потомства самок крыс с аутоиммунным поражением печени в различные сроки постнатального онтогенеза, %

Count of PAS positive cells of bone marrow monocyte lineage and peripheral blood monocytes in progeny of female rats with autoimmune liver injury at different stages of postnatal ontogenesis, %

Группа Group	Монобласты Monoblasts		Промоноциты Promonocytes		Моноциты КМ Bone marrow monocyte		Моноциты ПК Peripheral blood monocytes
	30-й день Day 30	60-й день Day 60	30-й день Day 30	60-й день Day 60	30-й день Day 30	60-й день Day 60	30-й день Day 30	60-й день Day 60
Контроль Control	2,23 (2,19-2,27)	2,28 (2,24-2,32)	2,35 (2,33-2,37)	2,45 (2,41-2,49)	2,44 (2,42-2,46)	2,56 (2,52-2,6)	2,48 (2,44-2,52)	2,58 (2,54-2,62)
Опыт Experimental	1,99* (1,91-2,07)	2,01* (1,97-2,05)	2,1* (2.04-2,16)	2,19* (2,13-2,25)	2,24* (2,18-2,3)	2,45* (2,39-2,51)	2,27* (2,25-2,29)	2,49* (2,39-2,59)

Примечание: * - 95 % ДИ.

Note: * - 95 % confidence interval.

В результате проведенных исследований получены результаты, свидетельствующие о снижении активности кислой фосфатазы в незрелых клетках моноцитарного ростка костного мозга и моноцитах периферической крови потомства матерей с патологией гепатобилиарной системы.

доказанно имеет место при высокой сенсибилизации организма [12].

В последние годы широкое применение получил метод выявления митохондриальных дисфункций по активности митохондриальных ферментов в лейкоцитах крови, отражающие полисистемные изменения всего

Интенсивность цитохимической реакции на кислую фосфатазу в клетках моноцитарного ростка костного мозга и моноцитов периферической крови у потомства самок крыс с аутоиммунным поражением печени в различные сроки постнатального онтогенеза, %

Intensity of acid phosphatase cytochemical reaction in cells of bone marrow monocyte lineage and peripheral blood monocytes in progeny of female rats with autoimmune liver injury at different stages of postnatal ontogenesis, %

Полученные нами данные находят подтверждение в ряде научных работ. При моделированных патологиях печени: токсической, аутоиммунной и холестатическом гепатите [3] происходит снижение киллинговой активности макрофагов, вероятно всего, обусловленное снижением активности кислой фосфатазы.

Кислая фосфатаза, в качестве маркера лизосом, отражает уровень дифференцировки и функциональной активности клетки [21]. Поэтому по снижению активности лизосомального гидролитического фермента в исследуемых нами клетках опытных групп можно судить об их функциональной неполноценности. Кроме того, секреция лизосомальных ферментов напрямую связана с состоянием стабильности клеточной мембраны: при лаби-лизации лизосомальных мембран происходит повышение выхода ферментов, при стабилизации - снижение [23]. Таким образом, повышенная активность, в данном случае, кислой фосфатазы в цитоплазме клеток подопытных животных наводит на мысль о нестабильности клеточных и лизосомальных мембран, что организма. В рамках этого проводится оценка активности, в том числе и митохондриального окислительно-восстановительного фермента -альфа-глицерофосфатдегидрогеназы, принимающего участие в гликолитическом пути расщепления углеводов. Уровень активности данного фермента напрямую зависит от эффективности митохондриального аппарата, а значит отражает степень обеспеченности клеток энергоемкими соединениями [12].

В ходе исследования нами было выявлено увеличение содержания а-ГФДГ в процессе постнатального развития в моноцитах периферической крови на рассматриваемых сроках экспериментальных групп. При анализе проводимого исследования обнаружена следующая закономерность - цитохимический коэффициент а-ГФДГ в опытной группе животных выше по сравнению с контролем.

Полученные нами результаты нашли подтверждение в работах ряда авторов, показавших аналогичную закономерность при моделировании хронического холестатического, аутоиммунного и токсического поражения гепатобилиарной системы [3].

Таблица 3

Table 3

Содержание а - ГФДГ в моноцитах периферической крови у потомства самок крыс с аутоиммунным поражением печени в различные сроки постнатального онтогенеза, %

Content ofa-GPDH in peripheral blood monocytes in progeny of female rats with autoimmune liver injury at different stages of postnatal ontogenesis, %

Группа Group	Сроки Stages
	30 день Day 30	60 день Day 60
Контроль Control	0,89(0,79-0,99)	1,1(1,02 1,18)
Опыт Experimental	1,15(1,09-1,21)*	1,29(1,23 1,35)*

Примечание: * - 95 % ДИ.

Note: * - 95 % confidence interval.

Обнаруженные изменения могут быть объяснены нарушением гликолитического пути расщепления углеводов в моноцитарных клетках у потомства матерей с хронической патологией печени, что, неизбежно ведет к нарушению углеводного обмена [7, 21].

Заключение. Таким образом, результаты проведенных исследований наглядно демонстрируют, что при моделировании хронического аутоиммунного гепатита у потомства самок крыс происходит системное нарушение процессов жизнеобеспечения [3], сопровождающееся, в том числе, угнетением костномозгового кроветворения. Это проявляется в нарушении дифференцировки и созревания клеток моноцитарного ростка костного мозга, уменьшением числа моноцитарных клеток на различных стадиях костномозгового развития, что обуславливает снижение числа моноцитов в периферической крови. Изменение численного состава моноцитов протекает на фоне снижения их функционального состояния, на что указывает снижение содержания гликогена, а также уменьшение интенсивности гистохимической реакции на кислую фосфатазу и а-ГФДГ. В целом полученные результаты позволяют считать, что у самок крыс с хроническим экспериментальным аутоиммунным поражением печени рождается потомство со сниженной резистентностью.