Морфофункциональные особенности эритроцитов Rana temporaria L. (AMPHIBIA, ANURA) при гипотермии

Гибернация земноводных является одной из форм биологического покоя, позволяющих сохранять жизнеспособность в условиях понижения температуры окружающей сре- ды. Среди лягушек есть виды с разной криорезистентностью (Берман и др., 2016). Лягушки рода Rana, такие как травяная, сибирская и дальневосточная (Rana temporaria L., 1758; Rana amurensis Boulenger, 1886; Rana dybowskii Gunther, 1876), зимуют как в воде, так и на суше, однако при переохлаждении способны переносить только малые отрицательные температуры (Берман и др., 2017).

Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов адаптации клеток к температурным изменениям, многие аспекты остаются недостаточно исследованными, особенно в контексте эритроцитов земноводных. Холоднокровные животные подвергаются значительным колебаниям температуры в зависимости от условий окружающей среды, что оказывает влияние на их функциональные характеристики и метаболизм. Известно, что у рыб эритроциты за счет кислородтранспортной и адаптивно-компенсаторной функций участвуют в поддержании гомеостаза организма при изменении условий среды (Чернявских и др., 2018). У рептилий отмечают разницу в форме и величине эритроцитов в зависимости от видовой принадлежности (Четанов, Четанова, 2021). Однако до сих пор остаются малоизученными молекулярные и биохимические механизмы, посредством которых у лягушек эритроциты адаптируются к этим изменениям.

В связи с этим вопрос о физиологических изменениях в организме лягушек при снижении функциональной активности является актуальным, поскольку его изучение позволит получить дополнительные сведения об особенностях гипобиоза пойкилотермных животных и о влиянии абиотического стресса на клеточные структуры и их функции.

Цель работы: изучить изменение морфо- метрических параметров эритроцитов при гибернации и при дополнительном холодовом воздействии.

Материалы

Все исследованные особи были самцами и отловлены в местах естественного обитания. Материал для исследования, включающий кровь от 24 особей травяной лягушки ( R. temporaria ), был собран в период с октября 2023 по февраль 2024 г. - период естественной гибернации вида в природе. Животные на протяжении нескольких месяцев содержались при температуре 10–12 °С без освещения и пищи в аквариальной комнате вивария.

Методы

После отлова проводили предварительную недельную акклимацию животных к условиям аквариальной комнаты. Для оценки изменения показателей эритроцитов в условиях гибернации и после холодового воздействия животных на 1, 33, 48 и 99-е сутки экспозиции отбирали по три особи для контрольного и опытного вариантов. Контрольные особи оставались в исходных условиях в течение семи суток, тогда как опытные подвергались холодовому воздействию при температуре 4 °C. Пониженные температуры моделировались с помощью климатической камеры TH-ME-25 (Jeio Tech Lab Companion), обеспечивающей постоянство температуры и влажности на протяжении семи суток эксперимента.

Акклимация

7 суток

Этап 2, 33 сутю ■

Этап 3,48 сутта ■

Этап 4, 99 сутю

Этап 1, 0 сутки

Опыт, 7 сутки

Опыт, 40 сутки

Опыт, 55 сутки

Опыт, 106 сутки

Рис. 1. Схема эксперимента

Fig. 1. The scheme of the experiment

Кровь отбирали после пункции сердца в пробирку, обработанную антикоагулянтом ЭДТА (ООО «МиниМед»). Мазки крови, окрашенные по Романовскому - Гимзе, просматривали и фотографировали на микроскопе «МИКМЕД-6» с камерой МС-5 (USB2.0) при увеличении (окуляр 10, объектив

40) (АО «ЛОМО», Россия). На каждом препарате измеряли длину и ширину для 100 клеток. Анализ микрофотографий и измерение линейных размеров эритроцитов и их ядер проводили в программе JMicroVision 1.3.4 (Roduit, 2019). Всего было обработано 75 микрофотографий мазков крови и измере- ны показатели у 2400 клеток по 100 для каждой особи, включенной в эксперимент.

Расчет морфометрических параметров эритроцитов проводили на основе измерения продольной и поперечной осей эритроцита ( C₁ и C₂ соответственно) и ядра ( N₁ и N₂ соответственно). Используя полученные линейные размеры проводили расчет ряда характеристик эритроцитов: показатель формы клеток ( MS ), объем клетки ( V c ), объем ядра ( V_n ), площадь поверхности клетки ( S c ), ядерно-цитоплазматическое отношение ( NCR ), удельную поверхность эритроцитов ( SS c ) (Кухарева, Солдатов, 2016). Согласно коэффициенту эксцентричности ( е ) выделяли три класса эритроцитарных субпопуляций: eliptocytus (нормальные эллипсоидные клетки) – коэффициент эксцентричности (ε) - 0.7-0.75; magnulocytus (широкоэллиптические клетки) - е > 0.76; teretiocytus (округлые клетки) – ε ≤ 0.69 (Скоркина, Зеленцова, 2004).

Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программ MS Office Excel, STATISTICA 10 (StatSoft Inc., США). Нормальность распределения оценивали с помощью метода Шапиро - Уилка. Для подтверждения достоверности различий между двумя выборками использовали либо U-критерий Манна – Уитни, когда наблюдалась ненормальность распределения, либо t-критерий Стьюдента при нормальном распределении. Для оценки качественных признаков использовали критерий соответствия χ2 Пирсона. Уровень значимости для всех видов сравнения принимался 0.05 ( p ≤ 0.05).

Использование и уход за экспериментальными животными соответствовал законам Российской Федерации по защите животных, а также руководящим принципам ARRIVAL и Директиве ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных.

Результаты

Первые отборы проб крови проводились у особей, отобранных из естественной среды в октябре и прошедших недельную ак-климацию к искусственно созданным условиям содержания (отсутствие освещения и питания, температура воздуха 14^15 °С). Далее на протяжении 106 суток лягушки содержались в условиях аквариальной комнаты (температура 10…12 °С, без света и пищи). Данные, полученные в октябре (начальный контроль) при первом снятии результатов, принимали в качестве исходных, как наиболее приближенные к естественным условиям среды, так как в этот период лягушки еще находились в относительно активном состоянии. Полученные исходные размерные параметры эритроцитов, такие как длина эритроцита по продольной (C1: 21.72 ± 0.10 мкм) и поперечной оси клетки (C2 16.32 ± 0.07 мкм) и ядра (N1 11.01 ± 0.08 мкм, N2 6.64 ± 0.07 мкм), позволили рассчитать основные характеристики эритроцитов: показатель формы клетки 1.33 ± 0.01; объем ядра 263.06 ± 7.27 мкм3, объем клетки 1058.77 ± 11.79 мкм3, площадь поверхности клетки 1233.05 ± 12.22 мкм2, ядерно-цитоплазматическое отношение 0.24 ± 0.01, удельная поверхность эритроцитов 1.17 ± 0.01 мкм2/мкм3. В эритроцитарной субпопуляции, согласно коэффициенту эксцентричности, преобладали округлые клетки (75.3 %) и нормальные эллипсоидные клетки (18.7 %), при этом количество широкоэллиптических клеток (6 %) было минимально.

По мере увеличения длительности содержания лягушек в аквариальной комнате для каждой серии экспериментов отбирали дополнительный контроль, поскольку в таких условиях животные постепенно переходили в состояние пониженной функциональной активности. Так, на 2-м этапе, после месячного периода гибернации, выявлены изменения в морфометрических показателях эритроцитов: C₁ 25.45 ± 0.2мкм, C₂ 19.67 ± 0.20 мкм, длина ядра по продольной оси N₁ 11.40 ± 0.13 мкм, по поперечной оси N₂ 7.22 ± 0.11 мкм. Изменились и основные параметры эритроцитов: показатель формы клетки 1.30 ± 0.10, объем ядра 337.80 ± 5.27 мкм³, объем клетки 1619.61 ± 42.43 мкм³, площадь поверхности клетки 1696.67 ± 50.93 мкм², ядерно-цитоплазматическое отношение 0.200 ± 0.004, удельная поверхность эритроцитов 1.22 ± 0.01 мкм²/мкм³ (табл. 1). При этом в эритроцитарной субпопуляции отмечено увеличение доли округлых клеток до 81.2 % за счет уменьшения количества нормальных эллипсоидных (12.0 %) и широкоэллиптических клеток (6.8 %).

Холодовая 7-суточная экспозиция лягушек при температуре воздуха 4 °С в климатической камере в этот же период повлияла на морфометрические показатели эритроцитов (см. табл. 1).

Таблица 1. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушки R. temporaria при воздействии пониженных температур (2-й этап)

Показатели эритроцитов        Контроль                 Опыт

MS                              1.30 ± 0.10*              1.26 ± 0.01**

• V_n, мкм³                        337.84 ± 5.27*           165.53 ± 5.27**

• V_c , мкм³                       1619.61 ± 42.43*         1002.50 ± 13.01**

S_c , мкм²                       1696.67 ± 50.93*         1233.05 ± 12.22**

NCR                          0.200 ± 0.004*           0.160 ± 0.004**

SS_c , мкм²/мкм³                  1.22 ± 0.01*              1.29 ± 0.01**

C₁ , мкм                         25.45 ± 0.25*            21.77 ± 0.12**

C₂ , мкм                         19.67 ± 0.20*             14.64 ± 0.1**

N₁ , мкм                         11.40 ± 0.13*             9.55 ± 0.09**

N₂ , мкм                         7.22 ± 0.11*              5.60 ± 0.07**

Примечание. * – достоверные различия между контролем на 1-м и 2-м этапах отбора особей, ** – достоверные различия между контролем 2-го этапа и опытной группой (U-критерий Манна – Уитни, р ≤ 0.05).

У особей, экспонировавшихся к пониженной температуре, отмечено уменьшение линейных размеров клетки на конец экспозиции: длина эритроцитов по продольной оси уменьшается на 19 %, поперечной - на 28.9 %, длина ядра по продольной оси уменьшается на 15.7 %, по поперечной оси – на 34.3 %. Вследствие этого изменяются и морфофункциональные параметры эритроцитов: уменьшаются на 3 % показатель формы клетки, объем клетки на 38 %, объем ядра на 51 %, площадь поверхности клетки на 27.3 %, ядерно-цитоплазматическое от ношение на 20 %. При этом отмечается увеличение удельной поверхности эритроцитов на 5.7 %. В эритроцитарной субпопуляции незначительно возрастает доля округлых клеток (89.2 %) за счет уменьшения количества нормальных эллипсоидных (7.7 %) и широкоэллиптических клеток (3.1 %).

Через полтора месяца содержания лягушек в контрольных условиях (3-й этап) отмечаются некоторые изменения в морфометрических показателях эритроцитов по отношению к первой съемке данных в исходной контрольной группе (табл. 2).

Таблица 2. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушки R. temporaria при воздействии пониженных температур (3-й этап)

Показатели эритроцитов        Контроль                 Опыт

MS                              1.48 ± 0.01*              1.54 ± 0.01**

• V_n , мкм³                       265.45 ± 12.28*           185.71 ± 4.52**

• V c, мкм³ _______________________ 1025.90 ± 13.58* __________ 947.48 ± 12.59**

S c, мкм² ________________________ 1179.05 ± 12.59 ___________ 1180.94 ± 15.18

NCR                          0.230 ± 0.008*           0.190 ± 0.003**

SS_с , мкм²/мкм³                 1.180 ± 0.013*           1.250 ± 0.004**

C₁ , мкм                          22.03 ± 0.11              22.23 ± 0.11

C₂ , мкм                         14.94 ± 0.06*             14.64 ± 0.10**

N₁ , мкм                         10.65 ± 0.14*             10.04 ± 0.07**

N₂ , мкм                         6.25 ± 0.10*              5.81 ± 0.05**

Примечание. * – достоверные различия между контролем на 1-м и 3-м этапах отбора особей, ** – достоверные различия между контролем 3-го этапа и опытной группой (U-критерий Манна – Уитни, р ≤ 0.05).

Длина эритроцита по продольной составила 22.03 ± 0.11 мкм, по поперечной оси клетки 14.94 ± 0.20 мкм; длина ядра по продольной оси 10.65 ± 0.14 мкм, по поперечной оси 6.25 ± 0.10 мкм. Изменились и основные параметры эритроцитов: показатель формы клетки 1.48 ± 0.01; объем ядра 265.45 ± 12.28 мкм3, объем клетки 1025.9 ± 13.58 мкм3, площадь поверхности клетки 1179.05 ± 12.59 мкм2, ядерно-цитоплазматическое отношение 0.230 ± 0.008, удельная поверхность эритроцитов 1.18 ± 0.013 мкм2/мкм3. При этом в эритроцитарной субпопуляции доля округлых клеток уменьшается до 28.1 % за счет увеличения количества нормальных эллипсоидных (37.3 %) и широкоэллиптических клеток (34.6 %).

После 7-суточной экспозиции при температуре 4 °С в этот период (3-й этап) выявлено статистически значимое снижение длины эритроцита как по продольной (на 6%), так и поперечной оси (на 7 %), уменьшение длины ядра по поперечной оси (на 3 %) (см. табл. 2). Отмечено статистически значимое увеличение показателя формы клетки на 4 %, уменьшение объема клетки и объема ядра на 30 % и 7.7 % соответственно, ядерно-цитоплазматического отношения на 17.4%. При этом наблюдается увеличение удельной поверхности эритроцита на 6 %. В

Таблица 3. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушки R. temporaria при воздействии пониженных температур (4-й этап)

Показатели эритроцитов	Контроль	Опыт
MS	1.67 ± 0.01*	1.45 ± 0.01**
V, мкм3	129.02 ± 2.18*	154.28 ± 2.87**
V , мкм3	876.28 ± 6.75*	1076.07 ± 9.23**
S, мкм2	1158.71 ± 9.43*	1424.20 ± 12.19**
NCR	0.140 ± 0.002	0.140 ± 0.002
SSc, мкм2/мкм3	1.320 ± 0.003	1.320 ± 0.003
C1, мкм	22.74 ± 0.08*	23.58 ± 0.09**
C2, мкм	13.66 ± 0.07*	16.36 ± 0.08**
N1, мкм	9.62 ± 0.05*	10.18 ± 0.06**
N2, мкм	5.01 ± 0.02*	5.31 ± 0.04**

Примечание: * – достоверные различия между контролем на 1-м и 4-м этапах отбора особей, ** – достоверные различия между контролем 4-го этапа и опытной группой (U-критерий Манна – Уитни,

р ≤ 0.05).

Экспозиция особей в течение 7 суток при температуре 4 °С в это время приводит к увеличению длины эритроцита по продольной оси на 5.8 %, по поперечной на 6 %, длина ядра по продольной оси на 3.6 %, по поперечной на 16.5 % (р ≤ 0.05). По функциональным показателям отмечено уменьшение по- эритроцитарной субпопуляции практически не меняется доля округлых клеток (27.8 %), увеличивается доля широкоэллиптических клеток (44.8 %) и снижается доля нормальных эллипсоидных эритроцитов (27.8 %).

После 3-месячной гибернации производили третий отбор крови для анализа морфометрических показателей эритроцитов (4-й этап). Обнаружено, что по отношению к данным исходной контрольной группы также произошли изменения в показателях эритроцитов (табл. 3). Длина эритроцита по продольной оси клетки составила 9.62 ± 0.05 мкм, по перечной 5.01 ± 0.02 мкм; длина ядра по продольной оси 22.74 ± 0.08 мкм, по поперечной оси 13.66 ± 0.07 мкм. Изменились и основные параметры эритроцитов: показатель формы клетки 1.67 ± 0.01; объем ядра 129.02 ± 2.18 мкм3, объем клетки 1076.07 ± 9.23 мкм3, площадь поверхности клетки 1424.20 ± 12.19 мкм2, ядерно-цито-плазматическое отношение 0.170 ± 0.003, удельная поверхность эритроцитов 1.270 ± 0.004 мкм2/мкм3. При этом в эритроцитарной субпопуляции максимально увеличивается доля широкоэллиптических клеток (82.4 %), снижена доля нормальных эллипсоидных эритроцитов (14.1 %) и минимальна доля округлых клеток (3.5 %).

казателя формы клетки на 13.2 %, увеличение объема ядра на 19.6 %, объема клетки на 22.7 %, площади поверхности клетки на 22.9 %. Что касается изменения соотношения эритроцитарных популяций, то после холодовой экспозиции отмечается уменьшение доли широкоэллиптических клеток

(26.7 %) за счет возрастания долей нормальных эллипсоидных (31.6 %) и округлых клеток (41.7 %).

Полученные данные показали, что на протяжении эксперимента с 1-х по 106-е сутки экспозиции в контрольной группе лягушек происходили изменения показателей эритроцитов. Поэтому дополнительно был проведен анализ изменения функциональ ных показателей эритроцитов у особей контрольных групп, содержащихся в аквариаль-ной комнате в условиях отсутствия освещения, питания и при температуре 10...12 ºС. Результаты показали, что по мере увеличения периода нахождения лягушек в данных условиях изучаемые показатели эритроцитов изменяются (табл. 4).

Таблица 4. Морфометрические показатели эритроцитов периферической крови лягушек R. temporaria контрольных групп за период экспозиции

Показатели эритроцитов	Период экспозиции, сутки
	1-й этап	2-й этап	3-й этап	4-й этап
MS	1.33 ± 0.01a	1.3 ± 0.10a	1.48 ± 0.01b	1.67 ± 0.01е
Vn , мкм3	263.06 ± 7.27a	337.8 ± 5.27b	265.4 ± 12.28a	129.02 ± 2.18с
Vc , мкм3	1058.77 ± 11.79a	1619.61 ± 42.43b	1025.90 ± 13.58a	876.28 ± 6.75с
S c , мкм2	1233.05 ± 12.22a	1696.67 ± 50.93b	1179.05 ± 12.59af	1158.71 ± 9.43df
NCR	0.24 ± 0.01a	0.20 ± 0.004b	0.23 ± 0.008a	0.14 ± 0.002е
SS е, мкм2/мкм3	1.17 ± 0.01a	1.22 ± 0.01b	1.18 ± 0.013е	1.32 ± 0.003d
C1 , мкм	21.72 ± 0.10ab	25.45 ± 0.25a	22.03 ± 0.11b	22.74 ± 0.08е
C2 , мкм	16.32 ± 0.07a	19.67 ± 0.20b	14.94 ± 0.06a	13.66 ± 0,.07е
N1 , мкм	11.01 ± 0.08a	11.40 ± 0.13b	10.65 ± 0.14a	9.62 ± 0.05е
N2 , мкм	6.64 ± 0.07a	7.22 ± 0.11b	6.25 ± 0.10е	5.01 ± 0.02d

Примечание. Различные надстрочные символы в каждой строке указывают на статистически значимые различия между этапами эксперимента (U-критерий Манна – Уитни, р ≤ 0.05).

Отмечается динамика изменения показателей эритроцитов от статистически значимого увеличения объема клетки, ядра, площади поверхности клетки, удельной поверхности эритроцитов до фактического возвращения к прежним значениям показателей через полтора месяца и повторного изменения к концу экспозиции.

Так, значение показателя формы клетки эритроцитов постепенно увеличивается на 3-м этапе на 11 % ( р ≤ 0.05), а к концу общей экспозиции имеет наиболее высокий показатель (увеличился на 21 %, р ≤ 0.05), что свидетельствует о том, что в кровотоке увеличилось количество эритроцитарных форм более вытянутой эллипсоидной формы. Продольная ось ( С₁ ) клетки увеличилась по сравнению с первыми сутками на 4.7 % ( р < 0.05), а поперечная уменьшилась на 16.2 % ( р < 0.05). Эта динамика подтверждается и по расчетам коэффициента эксцентричности - ростом к концу экспозиции доли субпопуляции широкоэллиптических клеток ( р <0.05).

Значения объема клетки и объема ядра, увеличиваясь (на 53 % и 28 % соответственно, р < 0.05) на 2-м этапе, к 3-му этапу возвращаются к контрольным данным, а к 4-му становятся значительно меньше (на 17.3 % и 49 % соответственно, р ≤ 0.05) начальных данных. По отношению к ядерно-цитоплаз-матическому соотношению прослеживается аналогичная динамика, только здесь через месяц отмечается уменьшение данного показателя (на 16.7 %), обусловленное ростом объема клетки, затем его возвращение к первоначальным данным на 3-м этапе и вновь снижение на конец экспозиции (на 35%), связанное с большим уменьшением объема ядра в сравнении с клеткой.

При оценке респираторных характеристик эритроцитов (диффузная площадь поверхности и удельная поверхность клетки) прослеживается аналогичная динамика: на 2-м этапе отмечается рост респираторных характеристик клетки ( S_c на 37.6 %, SS_c на 4.2 %, р < 0.05), затем снижение на 3-м (на 31 %, р < 0.05) и дальнейшее понижение значения площади поверхности клетки с одновременным ростом удельной поверхности к 4-му этапу. Показатель удельной поверхности эритроцитов при этом увеличивается на 8.8 %, что, вероятно, связано с относительной стабилизацией функциональности и адаптацией клеток при гипобиозе.

Все отмеченные показатели по мере уве- личения длительности экспозиции статистически значимо отличаются от первоначальных контрольных данных в зависимости от длительности экспозиции, что свидетельствует о происходящих изменениях в морфологии и функциональности эритроцитов в ответ на переход в состояние гипобиоза (см. табл. 4).

Аналогичная динамика прослеживается и по соотношению субпопуляций эритроцитов, выделяемых согласно коэффициенту эксцентричности. При первом снятии данных в исходной контрольной группе преобладает субпопуляция округлых клеток эритроцитов, при этом популяция широкоэллиптических клеток минимальна (табл. 5).

Таблица 5. Соотношение субпопуляций эритроцитов по коэффициенту эксцентричности за период экспозиции у лягушек R. temporaria

Тип субпопуляции эритроцитов	1-й этап	2-й этап	3-й этап	4-й этап
Нормальные эллипсоидные клетки	18.7а	12.0а	37.3b	14.1cf
Широкоэллиптические клетки	6.0а	6.8а	34.6b	82.4cf
Округлые клетки	75.3а	81.2а	28.1b	3.5cf

Примечание. Различные надстрочные символы в каждой строке указывают на статистически значимые различия между этапами эксперимента (критерий соответствия χ2 Пирсона, р ≤ 0.05).

По мере увеличения периода экспозиции наблюдаются изменения в соотношении разных субпопуляций эритроцитов в крови лягушек. Через месяц экспозиции статистически значимых изменений не выявлено, по-прежнему преобладают округлые клетки. К 3-му этапу выявлено статистически значимое изменение в соотношении эритроцитарных субпопуляций – все три группы имеют практически равные доли. Однако к концу экспозиции контрольной группы лягушек доля широкоэллиптических эритроцитов статистически значимо увеличивается, а доля округлых клеток снижается ( р < 0.001). Обсуждение

Одним из функциональных показателей, отражающих состояние организма, является изменение морфологических характеристик клеток эритроцитов, определяющих их респираторные свойства. Информация об изменениях этих параметров при снижении уровня биологической и физиологической активности, а также при переходе представителей земноводных в состояние биологического покоя представляет значительный интерес. Размер эритроцита является видоспецифической, стабильной характеристикой, которая сформировалась в ходе эволюции. Эритроцитарные клетки обладают способностью к изменению формы и размеров, что обеспечивает им возможность свободно проходить через микроциркуляторное русло (Липунова, Скоркина, 2004). Известно, что у земноводных эритроциты весьма чув- ствительны к воздействию неблагоприятных факторов среды (Минеева, Минеев, 2010). В связи с тем что более мелкие эритроциты характерны для животных с более высоким уровнем метаболизма, вероятно, их размеры могут выступать в качестве важного показателя адаптивной способности к концентрированию энергетических ресурсов (Ли-пунова, Скоркина, 2004; Четанов, Четанова, 2021). Эритроциты млекопитающих разных видов различаются по размеру и форме. Увеличение их размера позволяет достичь более высокой концентрации Hb и повысить способность крови переносить кислород. При этом размер эритроцитов взаимосвязан и с экологическими факторами обитания, такими как условия среды обитания, двигательная активность и др. (Kizhina et al., 2020; Трошкина и др., 2007).

Для взрослых лягушек R. temporaria, по данным литературы, нормальными условиями и предпочитаемыми температурами на суше являются 17…20 °С. Для них сезон активности определяется по числу дней в году при среднесуточной температуре выше +5 °С (Ляпков, 2012). В естественных условиях в осенний период лягушки постепенно готовятся к переходу в состояние гибернации, характеризующееся пониженной реактивностью организма, снижением активности процессов ассимиляции и диссимиляции, ограничением и ослаблением функционирования жизнеспособных структур клеток (Голдовский, 1977). Травяная лягушка отно- сительно устойчива к переохлаждению, а при температурах около 0 °С переходит в состояние гибернации, принимая характерную «зимовочную» позу (Берман и др., 2017).

В целях детального изучения влияния снижения функциональной активности на эритроциты был проведен анализ изменений их морфометрических показателей в ходе гибернации. Анализ показал наличие динамики изменения изучаемых показателей эритроцитов, отражающих изменение функционального состояния особей в условиях температуры 10…12 °С, при отсутствии пищи и освещения, связанное с перестройкой физиологических процессов. Длительная гибернация приводила к постепенному подавлению функциональной активности животных, что отражалось в показателях эритроцитов. Выявленное после 1 месяца значительное увеличение объема клетки и ядра (53 % и 28 %), площади поверхности клетки и удельной поверхности эритроцитов (37.6 % и 4.2 %) при одновременном уменьшении ядерно-цитоплазматического соотношения свидетельствует о том, что в клетках идет повышение обменных процессов в этот период. Через полтора месяца экспозиции отмечено постепенное возвращение практически всех показателей к исходным данным (кроме показателя формы клетки, он увеличивается, т.е. клетка становится более вытянутой по продольной оси формы). Данная тенденция уменьшения значений показателей наблюдается и к концу экспозиции на 4-м этапе, при этом отмечено увеличение удельной поверхности эритроцита. Причем в это время наиболее значительно уменьшается объем ядра, что свидетельствует о значительном снижении обменных процессов.

Возможно, полученные результаты связаны с разными функциональными особенностями. Исследования на самцах R. ridibunda показали, что в состоянии гибернации количество эритроцитов значительно ниже в сравнении с периодом весенне-летней активности, однако в некоторых случаях показана активация эритропоэза, приводящая к увеличению количества эритроцитов и уменьшению их объема (Липунова, Скоркина, 2004). С другой стороны, при переходе лягушек в более глубокую фазу биологического покоя уменьшение объема клетки и ядра может быть обусловлено снижением метаболизма, уменьшением количества свободной воды (Голдовский, 1977; Иванов, 2008; Жмакин, 2008), а соответственно, по- степенной дегидратацией эритроцитов.

Также отмечено, что по мере увеличения продолжительности экспозиции в крови контрольной группы лягушек наблюдаются изменения в соотношении эритроцитарных популяций. Статистически значимые изменения отмечены через полтора месяца гибернации, выражающиеся в постепенном увеличении и максимальном преобладании к концу экспозиции доли широкоэллиптических клеток. Трансформация формы эритроцита может быть связана с изменением проницаемости и текучести плазматической мембраны, что приводит к частичной дегидратации клетки. Стабильность и деформируемость мембран эритроцитов зависит от жестокости белковой сети цитоскелета и вязкостно-эластических свойств мембранных липидов. При этом деформируемость клетки снижается с увеличением вязкости внутриклеточного содержимого (Липунова, Скоркина, 2004).

Важно отметить, что за общий период экспозиции контрольной группы отмечается динамика практически всех показателей, что, вероятнее всего, связано с их скоррелированным изменением. Можно прийти к заключению, что сходная динамика изменения морфофункциональных показателей – снижение объемов ядра и клетки, уменьшение ЯЦО и площади поверхности клетки – свидетельствует о снижении активности обменных процессов эритроцитов в целом, что и отражает переход организма в состояние биологического покоя.

Считается, что температура 4 °С – это верхняя граница холодового воздействия, однако она не является критичной для выживания лягушек. Известно, что они остаются относительно активными и при более низких значениях температуры 3...5 °С (Берман и др., 2017). С другой стороны, результаты экспериментов показывают, что семисуточная экспозиция лягушек при данной температуре приводит к значительным изменениям морфометрических показателей эритроцитов и зависит от общей функциональной активности животного.

Так, после холодового воздействия (+4 °С) у лягушек, находившихся в состоянии гибернации в течение одного месяца, выявлено уменьшение объема клетки и ядра, ядерно-цитоплазматического отношения, площади поверхности клетки при одновременном увеличении удельной поверхности эритроцитов, что свидетельствует о преобладании в кровяном русле эритроцитов более окру- глой формы и меньших размеров. Выявленные изменения свидетельствуют о снижении уровня обменных процессов в эритроцитах, их респираторных характеристик и проявлении компенсаторных реакций. Стоит отметить, что холодовое воздействие после месячной гибернации приводит к наибольшим изменениям в морфрометрических показателях эритроцитов по сравнению с результатами дальнейших опытов. Вероятно, выявленные изменения связаны именно с компенсационными изменениями на уровне клеточных элементов, а не изменениями процессов эритропоэза. Это подтверждается и данными контрольной группы, согласно которым обменные процессы эритроцитов в этот период возрастали по сравнению с первыми сутками экспозиции.

При холодовом воздействии через полтора месяца гибернации выявлено, что размеры клетки и ядра по сравнению с контрольной группой также уменьшаются, но уже не так активно (30 % и 7.6 % соответственно). Одновременно отмечается уменьшение значения ядерно-цитоплазматического отношения, а площадь поверхности клетки не изменяется при увеличении ее удельной поверхности. Подобное изменение показателей свидетельствует о снижении реактивности организма при отсутствии глубокой гибернации.

Однако через три месяца гибернации холодовое воздействие приводит к иному эффекту: увеличению размеров эритроцитов за счет увеличения объемов ядра, клетки и площади ее поверхности. При этом значения ядерно-цитоплазматического отношения и удельной поверхности клетки не изменяются. Подобные изменения, например увеличение объема эритроцита, отмечаются и у эритроцитов Carassius gibelio при инкубации крови при температуре +5 °С (Чернявских, 2018).

Полученные нами результаты, свидетельствующие об изменениях морфометрических параметров эритроцитов, подтверждают имеющиеся в литературе данные о том, что параметры красных клеток изменяются как при пониженной, так и при повышенной температуре (Чернявских, 2018). В связи с этим можно предположить, что в условиях семисуточного холодового воздействия происходящее увеличение размеров эритроцитов является приспособительной реакцией для сохранения объема обменных процессов. Согласно литературным данным, при пониженной температуре инкубации у эритроцитов отмечается снижение упругости и адгезии клеток (Чернявских, 2018). Косвенно это может свидетельствовать о работе адаптивных механизмов, связанных с уменьшением функциональной активности клеток в условиях гипотермии. Так, диффузионная поверхность эритроцитов после месячной гибернации и холодовой нагрузки снижается, на 2-м этапе (полтора месяца гибернации) не отличается от контрольных значений, а через три месяца экспозиции аналогичное воздействие приводит к ее повышению. Это свидетельствует о зависимости ответной реакции организма на холодовое воздействие, в частности респираторных характеристик эритроцита, от состояния организма.

Анализ влияния холодового воздействия (4 °С) в течение 7 суток на соотношение эритроцитарных субпопуляций показал, что статистически значимые отличия от контрольной группы отмечены только на последнем этапе общей экспозиции. Выявлено значительное снижение доли широкоэллиптических клеток и рост доли округлых клеток. Возможно, это связано именно с воздействием данной температуры и является одним из адаптационных механизмов к гипотермическому стрессу.

Заключение

Полученные результаты исследования эритроцитов лягушки R. temporaria демонстрируют значительные изменения в морфофункциональных показателях клеток при понижении физиологической активности организма и в ответ на холодовое воздействие. При этом выраженность ответного эффекта зависит от длительности гибернации, а соответственно, и функционального состояния организма. Подтверждена высокая вариабельность форм эритроцитов у лягушек и наличие зависимости соотношений эритроцитарных субпопуляций от физиологического состояния особи.