Морфологические изменения полевых изолятов рода Trichoderma после применения гербицидов

В природной среде мицелиальные грибы могут испытывать дефицит в питании и конкуренции в борьбе за выживание. Изучение грибов Trichoderma представляет большой интерес в связи с их использованием в сельском хозяйстве. Прогресс в сельском хозяйстве на сегодняшний день должен быть основан на уменьшении агрохимических затрат (выполнение Директивы 2009/128 / EC об устойчивом использовании пестицидов), этого можно добиться за счет использования полезных мицелиальных грибов и бактерий.

Мицелиальные грибы часто игнорируются в исследованиях кишечных микробов у сельскохозяйственных животных из-за низкого уровня присутствия в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных. Однако многие грибковые заболевания приводят к большим экономическим потерям в сельскохозяйственных и птицеводческих хозяйствах из-за производства микотоксинов и вторичных мицелиальных метаболитов которые могут образоваться в зерне, кормах для птицы и животных.

Виды грибов Trichoderma обычно встречаются во всех типах почв, и некоторые из них обладают способностью очищать загрязненную окружающую среду и могут применяться в качестве эффективных микроорганизмов для биоремедиации загрязнителей [5].

Препараты на основе Trichoderma успешно используются за рубежом в качестве биоудобрения, как альтернативу химическим удобрениям, применение которых в сельском хозяйстве наносит значительный урон окружающей среде [1]. Виды грибов Trichoderma являются продуцентами ферментов (целлюлаз, хитиназ, пектиназ и др.), используются в промышленности, в производстве получения спирта, моющих средств, кормовых добавок, применяются для биоконтроля и для стимуляции роста растений [4]. Исследованиями было доказано, что триходерма может стимулировать рост и развитие растений. Мицелий гриба способен продуцировать ростовые вещества, защищать растения и увеличивать поглотительную способность питательных веществ в почве [2]. Основным эко-санитаром в сельском хозяйстве является плесневый гриб рода Trichoderma, который занимает важную роль, как гриб антагонист с подавлением развития фитопатогенов. В окружающей среде, в почве, мицелий триходермы питается мертвыми полуразложившимися остатками растений, которые концентрируются в основном у корневой системы растений. Trichoderma в отношении ряда патогенных грибов рода Fusarium, Aspergillus, Cladosporium проявляют биотрофные свойства как факультативные микопаразиты [3]. На сегодняшний день триходерма применяется в биологических разработках как универсальное средство с вредителями и болезнями сельскохозяйственных культур и плодово-ягодных деревьев. По данным ученых один из видов T.viride, снижает выбросы закиси азота (N2O) из субтропических чайных полей. Плесневые грибы Trichoderma способствуют снижению ионов кадмия в почве, пестицидов, обладают способностью к биоремедиации при различных условиях pH и концентрации. Также широко применяются гербициды из класса фосфорорганических соединений (ФОС) на основе глифосфата или N-(фосфонометил)-глицина, которые могут антагонистически влиять на плесневелые грибы.

Целью наших исследований являлось изучение морфологических изменений полевых изолятов рода Trichoderma после применения глифосата.

Материал и методы исследований. Исследования проводили в лаборатории микотоксинов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Казань).

Для микологического анализа, отбирали пробы почвы по сельхозугодиям в разных районах Республики Татарстан. В каждой определенной зоне была выделена одна пробная площадка. Пробы почв брали с поверхностного слоя земли (глубиной не более 10 см). Пробы помещали в двойные зип-пакеты, которые направляли в лабораторию. Отобранные пробы замораживали и хранили при температуре -20 0С до проведения микологического исследования. Для выделения грибов рода Trichoderma применяли метод серийных разведений с последующим посевом на плотные питательные среды. Чашки Петри инкубировали при температуре 23-25 0С в течение 96 часов, после проводили макро -и микроскопический осмотр. Выросшие колонии отделяли методом пересева, для этого с помощью микологического крючка отбирали кусочек мицелия и помещали на поверхность агаризированной среды Чапека. Агаризированная среда Чапека с желчью состояла из: сахарозы – 30 г; натрия азотнокислого – 2 г; калия фосфорнокислого однозамещенного – 1 г; магния сернокислого – 0,5 г; калия хлористого – 0,5 г; железа сернокислого закисного – 0,01 г; желчи медицинской – 100 мл; воды дистиллированной – 1000 мл; агар-агара – 25 г; pH 5,0-5,5.

Идентификацию грибов проводили на 4 сутки после посева, микологическим крючком и с помощью препаровальной иглы из чашки отбирали частицы мицелия со спороношением, помещали на предметное стекло, добавляя каплю фиксирующей жидкости лактофенола Аммана (дистиллированная вода 1 часть, молочная кислота 1 часть, глицерин 2 части, фенол 1 часть). Затем промывали препарат 96 % этилацетатом и покрывали покровным стеклом, микроскопию препарата проводили при увеличении х10 и х 40. Дифференцирование грибов проводили по определителям Саттон Д. с соавт. (2001), Билай В.И., Курбацкая З.А. (1990).

Выделенные изоляты грибов рода Trichoderma T.koningii, T.veride, T.harzianum, T. asperellum, инкубировали при температуре 23 0С в течении 96 часов.

Готовили водный экстракт мицелия грибов рода Trichoderma на дистиллированной воде в разведении 106, с добавлением 10 %-го разведенного препарата глифора. Водные экстракты изолятов оставляли при температуре – 4 0С и делали высевы на питательные среды через 24, 48, 72 часа. Глифор – гербицид из класса фосфорорганических соединений (ФОС), где основное действующее вещество глифосфат или N-(фосфонометил)-глицин.

Результат исследований. Грибы рода Trichoderma – активно участвуют в образовании гумуса в лесных сообществах почвенных и водных микроорганизмов, в перераспределении органических и неорганических веществ.

При изучении морфологических изменений грибов рода Trichoderma после применения глифосфата оценивали активность штамма по скорости радиального роста колонии, изменение цвета мицелия на классических питательных средах Чапека. С помощью микроскопии препарата анализировали поражения акоспор и изменения мицелий гриба и скорость восстановления.

Выделенные грибы T.koningii, T.asperellum, T.harzianum, T.veride обладали типичными морфологическими свойствами.

Trichoderma koningii характеризовался зелеными или темнозелеными колониями. Одноклеточные конидии, почти шаровидные (2,5-3,7 мкм), собраны в головки по 11-17 штук на концах, разветвленных конидиеносцев. Гриб образовывал шаровидные хламидоспоры размером 7,5-15 мкм, поверхность стром плоская, морщинистая, аски с отверстием. Мицелий грибов рода T. koningii 5-7 сутки полностью купировал рост на чашках Петри.

T. asperellum – спороношение гриба интенсивное, в центральной части чашки Петри колонии хорошо окрашены в темнозеленый цвет, по мере удаления колонии от центра к краю, цвет становился желтоватым. Колонии гриба росли быстро, за 96 часов достигая краев чашки Петри. Спороношение происходило на 4 день от 1 до 6 мм, споры гриба располагались равномерно, концентрическими зонтами. Конидиеносцы гриба рода T. asperellum симметричны и формировались в подушечках, очень редко шло формирование в воздушном мицелии.

T.harzianum – стромы гриба одиночные, цилиндрические диаметром 0,3 до 3 мм. Колоний гриба темно-зеленого цвета. Спороношение обильное, аски цилиндрические, размером 44 нм, акоспоры зеленые, бородавчатые, диморфные.

T.veride – стромы одинокие, немного распростертые, бархатистые, поверхность строма плоская, аски цилиндрические 6-10 нм, прозрачные, конической формы.

Результаты исследований показали, что через 48 часов после контакта штамма гриба Trichoderma harzianum с гербицидом отмечалось изменение морфологической структуры мицелия, подавление роста спороношения, изменением количества акоспор, меняется цвет гриба на зеленый и структура тяжей становятся редкими, более тонкими по структуре (Рисунок 1, 2). По истечению 96 часов роста гриба Trichoderma harzianum проявлял устойчивость к гербициду и имел прежнюю морфологическую структуру.

а) до применения глифосата

Рисунок 1 – Микроскопия препарата при увеличении 40 х Trichoderma harzianum до (а) и после (б) применения глифосата

б) после применения глифосата

После 48 часового инкубирования после применения глифосфата, мицелий гриба T.asperellum становится четко единичным, ограниченным по строению, конидии гриба вытягиваются, стенки становятся толще и по истечении 96 часов не восстанавливаются. Полевой изолят T.asperellum требует больше времени на восстановление структуры и цвета мицелий.

У мицелиального гриба T.veride после применения гербицида по истечении 48 часовой экспозиции наблюдались характерные утолщения конидий и уменьшение акоспор. При микроскопии изменялась структура и форма конидий, становилась более обьемной, терялся цвет гриба от темно-зеленого до светлого. Через 96 часов гриб T.veride принимал идентичную форму и цвет (Рисунок 2).

• а) до применения гербицида                б) после применения гербицида

Рисунок 2 – Микроскопия препарата при увеличении 40х мицелиального гриба T. veride до (а) и после (б) применения гербицида

После применения гербицида по истечению 48-96 часов, мицелий гриба T.koningii становился более уязвим, изменял морфологическую структуру, уменьшалось количество аскоспор, что приводило к определенным реструктиризациям выживаемости. При микроскопии гриба видны более утонченные,        лоскутно-отрывистые конидии, отмечалось изменение цвета от белого до серо-зеленого, рост гриба больше локализовался по краю колоний

Для     восстановления     гриба

T.koningii требовалось больше времени, чем 96 часов (Рисунок 4).

Рисунок 4 – Микроскопия препарата при увеличении 40х мицелиального гриба T.koningii

спустя 48 часов после применения глифосата

Заключение. При иследовании грибов рода T.harzianum, T.asperellum, T.veride, T.koningii установили разную устойчивость к гербициду. Более выраженные изменения были у гриба рода T.koningii. Контактирование с гербицидом этого изолята сопровождалось изменением морфологической структуры гриба и пигментации (с зеленого цвета на желтый). Микроскопия микологического препарата показала, слом кониденосцев, утончение стенок конидий, уменьшение количества аскоспор. T.asperellum при воздействии гербицида после 48 часов менял форму конидий, происходило уменьшение стенок конидиеносцев, при визуальном осмотре после 48-96 часов цвет колоний гриба был прозрачным, слегка белесым. Наиболее устойчивым к глифосфату оказался изолят T.harzianum, который через 48 ч был способен к быстрому восстановлению мицелия. Таким образом при совместном применении биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma и гербицидов на основе глифосфата может замедляться действие первых, что должно учитываться при их разработке и применении.

Целью исследований стало изучение морфологических изменений грибов рода Trichoderma при применении глифосата с интервалом 24, 48, 96 часов. Выделенные изоляты T.koningii, T.veride, T.harzianum, T.asperellum, разведенные в водном экстракте в разведении 106 экстрагировались в 10 % препарате глифор (действующее вещество глифосат). После каждой 24, 48, 96 часовой экспозиции, проводились контрольные высевы на агаризированные среды Чапека. После инкубирования при температурном режиме 23 0С, проводили визуальный осмотр и микроскопию колоний грибов, учитывая цвет, структуру и консистенцию конидий. Более подверженным к химическому воздействию оказался гриб рода T.koningii, что проявлялось изменением роста мицелия, характерными рваными конидиеносцами и уменьшением количества акоспор на питательной среде Чапека. T.asperellum при воздействии гербицида после 48 часов менял форму конидий, происходило уменьшение стенок конидиеносцев, при визуальном осмотре после 48-96 часов цвет колоний гриба был прозрачным, слегка белесым. Наиболее устойчивым к глифосату оказался изолят T.harzianum, который через 48 ч был способен к быстрому восстановлению мицелия. Таким образом при совместном применении биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma и гербицидов на основе глифосата может замедляться действие первых, что должно учитываться при их разработке и применении.