Морфологические параметры слизистой оболочки желудка беспородных белых крыс, используемых в эксперименте

Введение. Неэрозивные и эрозивно-язвенные поражения верхних отделов желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит, гастродуоденит, язвенная болезнь) чрезвычайно распространены как в человеческой популяции, так и у домашних животных [6], в связи с чем возникла необходимость в исследовании гистологического строения слизистой оболочки желудка (СОЖ) человека и млекопитающих и, в частности, белых крыс, поскольку неинбредные белые крысы широко используются для воспроизведения в экспериментальных условиях патологии человека и доклинической апробации новых лекарственных препаратов. Кроме того, необходимо детальное исследование процессов пролиферации и апоптоза в эпителии СОЖ,   характера муцинов, продуцируемых эпителиоцитами слизистой желудка, закономерностей изменения характера их зонального распределения.

Цель настоящей работы – иммуногистохимическое, гистологическое и гистохимическое исследование слизистой оболочки желудка неинбредных белых крыс.

Материалы и методы исследования. В эксперименте использовано 30 неинбредных белых крыс четырехмесячного возраста обоего пола со средней массой тела 170,5±9,1 г, содержащихся в стандартных условиях вивария, имеющих свободный доступ к пище и воде и 12-14-часовой световой день. Животные получали типовой рацион вивария в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10 марта 1966 г. № 163 и Приказом Минздрава СССР от 10.10.83 № 1179, п. 4.1. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу

Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Для отбора образцов стенки желудка животных выводили из эксперимента с соблюдением правил эвтаназии. Гистологические препараты готовили в соответствие со стандартными методиками. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по ван Гизону. Для гистохимического выявления муцинов использовали ШИК-реакцию с постановкой контрольных реакций, окраску альциановым синим при рН 2,5 (для выявления кислых несульфатированных гликозаминогликанов) и рН 0,5-1,0. Для проведения полуколичественной оценки результатов и расчета среднего цитохимического коэффициента (СЦК) пользовались принципом Астальди и Берга (1967), основанным на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски клеток. Подсчет клеток в гистологических препаратах осуществляли при увеличении микроскопа х 400 на тестовой площади 0,042 мм2.

При проведении иммуногистохимических исследований применяли антитела и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенный для проведения экспериментальных исследований. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении х 600. Оценка интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации проводились полуколичественным методом: учитывалось число позитивных результатов на 100 учтенных ядер (при подсчете 500-1000 клеток) [3]. Гибель клеток в форме апоптоза в эпителиоцитах толстой кишки определяли по индексу апоптоза (IАПТ) по формуле: IАПТ (%) = N (число апоптозных клеток, позитивных к Fas Ligand)/N1 (общее число клеток)×100 [5].

С целью выявления пролиферативной активности в слизистой оболочке желудка использовали моноклональные антитела к регуляторному протеину Ki-67 (Rabbit Monoclonal Antibody to Human Ki-67, Clone SP6, Isotype IgG). Активность апоптоза изучали с помощью иммуногистохимического исследования экспрессии Fas ligand на поверхности эпителиальных клеток (Polyclonal Rabbit Antibody to Fas Ligand). Для идентификации муцинов использовали моноклональные антитела к муцину MUC 5АС (Monoclonal Mouse Antibody to Mucin 5AC / Gastric Mucin, Clone 45M1, Isotype IgG1).

Результаты и их обсуждение. Стенка желудка неинбредных белых крыс представлена слизистой оболочкой, подслизистой основой, мышечной и серозной оболочками. Слизистая оболочка пищеводного отдела образована многослойным ороговевающим эпителием, собственной соединительнотканной пластинкой и мышечной пластинкой слизистой оболочки (lam. muscularis mucosae). Переход многослойного эпителия в железистую часть хорошо визуализируется. Слизистая оболочка железистой (фундальной, кардиальной и пилорической) части представлена однослойным однорядным цилиндрическим эпителием, выстилающим желудочные ямки, в основание которых открываются железы желудка. Подслизистая основа, представленная соединительной тканью, не содержит желез. Мышечная оболочка хорошо развита и состоит из трех слоев. Снаружи желудок покрыт серозной оболочкой, состоящей из однослойного плоского эпителия — мезотелия и слоя соединительной ткани.

Иммуногистохимические исследования выявили экспрессию муцина MUC5АС в цитоплазме клеток ямочного эпителия при отсутствии окрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез.

При гистохимическом исследовании слизистой оболочки желудка при окрашивании по методу ШИК интенсивная реакция обнаружена в эпителиальных клетках в области желудочных ямок и шеек желудочных желез. В теле желез выявляются единичные слабоокрашенные эпителиальные клетки, ШИК-положительный секрет которых сосредоточен в апикальной части клетки. Отношение ШИК-реакции к диастазе и фенилгидразину позволяет считать, что в состав секрета входят нейтральные муцины. Установленный в гистохимических исследованиях СЦК составил 2,4 ± 0,082 (табл. 1).

• 1.    Результаты полуколичественного определения интенсивности окрашивания эпителиальных клеток (значения СЦК) при гистохимической идентификации состава муцинов СОЖ интактных неинбредных белых крыс

  Метод окрашивания	Идентифицируемые мукополисахариды	Зона максимальной интенсивности окрашивания	Значения СЦК в зоне максимальной интенсивности окрашивания
  Реактив Шиффа (ШИК-реакция)	Нейтральные муцины	Эпителий желудочных ямок	2,4 ± 0,082
  Альциановый синий, рН-2,5	Кислые муцины	Эпителиоциты дна и тела желудочных желез	1,51 ± 0,057
  Альциановый синий, рН-1,0	Сульфомуцины	Эпителиоциты дна и тела желудочных желез	0,96 ± 0,034

Кислые гликозаминогликаны в эпителии СОЖ животных выявлялись преимущественно в эпителиоцитах дна и частично тела желудочных желез. При полуколичественном определении интенсивности окрашивания СЦК составил 1,51 ± 0,057 (табл. 1).

Сульфатированные гликозаминогликаны в эпителии СОЖ интактных животных также выявлялись только в эпителиоцитах дна и тела желудочных желез. При полуколичественном определении интенсивности окрашивания СЦК составил 0,96 ± 0,034 (табл. 1).

Известно, что нейтральные муцины, гистохимически выявляемые ШИК-реакцией, иммуногистохимически - при идентификации MUC 5AC, выявляются в поверхностных отделах слизистой оболочки желудка, им отводится протективная, защитная роль, а кислые муцины, выявляемые при окраске препаратов альциановым синим с рН-2,5, в норме выявляются в глубоких отделах СОЖ, выполняют протективную роль [4]. Наибольшее количество ШИК-позитивной слизи содержится в ямочном эпителии, в условиях патологии – в эпителиоцитах фундальных желез [2]. Таким образом, локализация MUC5АС и нейтральных и кислых мукополисахаридов в эпителии СОЖ интактных животных соответствует таковой в эпителии СОЖ человека, что позволяет использовать неинбредных белых крыс в качестве экспериментальной модели при исследовании поражений желудка в экспериментах на животных.

Исследование экспрессии регуляторного протеина Ki-67 в слизистой оболочке желудка крыс показало низкий уровень клеточной пролиферации. При этом пролиферирующие клетки выявлялись, в основном, в эпителии шейки и перешейка желудочных желез. Количественная оценка уровня пролиферации эпителиоцитов в этой экспериментальной группе соответствовала индексу пролиферации 12,34±1,16%.

У животных контрольной группы в эпителии желудочных ямок выявлена низкая экспрессия Fas Ligand, количественно оцениваемая как индекс апоптоза=4,52±0,38%, что также согласуется с литературными данными - 3,9±0,32 [1].

Выводы. При проведении морфологического исследования стенки желудка интактных неинбредных белых крыс установлено, что ее строение соответствовало нормальному с учетом особенностей данного вида.

• 1.    Гистохимическими исследованиями в эпителии СОЖ интактных неинбредных белых крыс при окрашивании Шифф-йодной кислотой нейтральные мукополисахариды выявлялись преимущественно в цитоплазме эпителиоцитов желудочных ямок и шеек желудочных желез. Напротив, кислые мукополисахариды, а также сульфомуцины в эпителии СОЖ интактных животных обнаруживались в эпителиоцитах дна и тела желудочных желез.

• 2.    При проведении иммуногистохимических исследований экспрессия муцина MUC5АС была выявлена в цитоплазме клеток ямочного эпителия при отсутствии окрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез, что соответствует типичному зональному распределению муцинов в желудке млекопитающих.

• 3.    В СОЖ интактных животных выявлен низкий уровень клеточной пролиферации; при этом пролиферирующие клетки выявлялись, в основном, в эпителии шеек желудочных желез.

• 4.    В СОЖ интактных неинбредных белых крыс выявлена низкая экспрессия Fas Ligand.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Аскаров, М.Б. Трансплантация аутологичных клеток костного мозга для лечения длительно незаживающих язв желудка: автореф. дис. … д-ра мед. наук/М.Б. Аскаров – М., 2009. – 46 с. 2. Вусик, М.В. Клинико-морфологическая оценка результатов эндоскопической лазерной терапии у больных раком желудка в ранние сроки после дистальных субтотальных резекций / М.В. Вусик, Н.Г. Крицкая, В.А. Евтушенко // Сибирский онкологический журнал. – 2006. - №3. – Т. 19. – С. 34-40.  3. Корсакова, Н.А. Оценка степени злокачественности эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения иммунофенотипа опухолевых клеток: автореф. дис. … к-та мед. наук / Н.А. Корсакова. – М., 2007. – 23 с. 4. Лининг, Д.А. Пролонгированная оценка обратного развития морфологических изменений слизистой оболочки желудка в результате эрадикации Helicobacter pylori / Д.А Лининг: автореф. дисс… канд. мед. наук. / Омск, 2006. – 23 с. 5. Осадчук, О.М. Показатели пролиферации и апоптоза в патогенезе и прогнозировании течения заболеваний желудка, ассоциированных с Helicobacter pylori / О.М. Осадчук, Н.Ю. Коган, И.М. Кветной // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2004. - Т. 17, № 4. – С. 20-24. 6. Приворотский, В.Ф. Хронические гастриты и гастродуодениты у детей / В.Ф. Приворотский, Н.Е. Луппова // Рос. сем. врач. – 2003. – Т. 7. - № 1. – С. 50-61.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА БЕСПОРОДНЫХ БЕЛЫХ КРЫС, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Черанева М.В.

Резюме

Представлена подробная характеристика слизистой оболочки желудка (СОЖ) интактной неинбредной белой крысы, широко применяемой российскими исследователями в экспериментальных целях с использованием современных иммуногистохимических, гистологических и гистохимических методик. Охарактеризовано нормальное распределение муцина MUC 5AC в СОЖ интактных животных, на основании экспрессии проапоптотического белка Fas ligand и экспрессии регуляторного протеина Ki-67 установлены индекс пролиферации (ИП) и индекс апоптоза (IАПТ) в эпителиоцитах СОЖ.

MORPHOMETRIC PARAMETERS OF OUTBRED WHITE RATS’ GASTRIC MUCOSA USED FOR EXPERIMENTAL PURPOSES

Cheraneva M.V.