Морфометрическая характеристика мезонефральных проксимальных канальцев в эмбриогенезе у сирийских хомяков (Mesocricetus auratus)

Первичная почка – провизорный эмбриональный орган, который является фило- и онтогенетическим субстратом формирования дефинитивной мочевой системы. У большинства видов млекопитающих и человека первичная почка состоит из мезонефронов, образованных почечным тельцем и канальцем, дифференцированным на проксимальный и дистальный отделы, при этом структура мезонефрона сравнима со структурой нефрона окончательной почки [4, 6, 8–21].

Вместе с тем, в ряде статей, касающихся изучения закономерностей формирования мочевой системы у млекопитающих, приведены данные, свидетельствующие об особенностях структуры нефрона мезонефроса у представителей отряда грызунов [5], это несколько противоречит общепринятой филогенетической схеме. Системные исследования механизмов образования и структуры мезонефроса у большинства видов представителей отряда грызунов отсутствуют.

Материал и методы

Работа выполнена на 277 эмбрионах сирийских хомяков (класс Mammalia, отряд Rodentia, семейство Cricetidae, род Mesocricetus, вид Mesocricetus auratus), полученных от самок с датированным сроком беременности 8–13 сут post coitus (рс) с интервалом 6 ч, что соответствует 11–20-й стадиям эмбрионального развития [3], на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии БО ХМАО-Югры «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия». Все манипуляции с экспериментальными животными проведены в соответствии с действующими нормативными документами (приказ МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755 «О гуманном обращении с экспериментальными животными»; «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утв. приказом Министерства высшего и среднего профессионального образования СССР от 13.11. 1984 г. № 742). Спаривание животных проводилось в летний период в вечернее время суток (18-00–20-00) 2012–2014 гг. У беременных самок в условиях эфирного наркоза проводилась лапаротомия, иссекались эмбрионы из правого и левого рогов матки. На каждом сроке развития изучены зародыши, полученные от трех-четырех самок. Эмбрионы фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине на фосфатном буфере «Биовитрум», заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 3 мкм окрашивали гематоксилином Караци и эозином [7]. Препараты подвергнуты световой микроскопии с использованием микроскопа Axio Imager Z1 (Zeiss, Германия). Измеряли минимальные диаметры поперечных срезов и просветов проксимальных мезонефральных канальцев с применением программы Axio Vision 4.6.3. Определяли площади поперечного сечения и просвета канальцев по формуле S = πА²/4, где А – величина малого диаметра канальца в мкм. Площадь эпителия стенки канальцев фиксировали как разницу площадей канальца и его просвета [1, 2]. В каждой возрастной группе эмбрионов изучено от 80 до 170 канальцев.

Формирование базы данных произведено при помощи программы Microsoft Office Excel 2013. Полученные результаты обрабатывались с помощью программы Statistica 8.0. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. В случае превышения достигнутого уровня значимости статистического критерия этой величины принималась нулевая гипотеза. Величину вероятности, имеющую более 6 нулей после запятой, обозначали как р меньше 0,001 ( р < 0,001). Для сравнения двух независимых выборок применяли U-критерий Манна-Уитни.

Результаты исследований

В результате проведенных исследований установлено, что первичная почка у эмбрионов сирийского хомяка существует в период с 9 сут 6 ч до 13 сут 6 ч рс, что соответствует 13– 20-й стадиям развития.

В результате микроскопии установлено, что на 11-й стадии развития в теле зародыша завершается гаструляция, начинается формирование осевых органов, наиболее значимыми морфогенетическими событиями являются нейруляция и преобразования мезодермы: выделяются сомиты, латеральные пластинки мезодермы и промежуточная мезенхима. В течение 12-й стадии развития выделяются краниальный и каудальный участки тела зародыша, тело принимает С-образную форму, определяется головной изгиб, формируются мозговые пузыри, глазные пузыри, кишечная трубка, сердечная трубка, эмбриональные аорты, печеночная бухта.

К окончанию 13-й стадии первичная почка располагается по задней стенке тела в кранио-каудальном направлении, содержит продольно ориентированный мезонефральный проток, ме-зонефральные канальцы, располагающиеся перпендикулярно протоку, и кровеносные сосуды (рис. 1). Мезонефральные канальцы дифференцированы на проксимальный и дистальный отделы (канальцы). Верификацию проксимальных канальцев осуществляли с помощью морфологических критериев [5].

Проксимальные канальцы (рис. 2) имеют сравнительно больший диаметр, образованы одним слоем цилиндрических клеток, слепо начинаются в мезенхиме и продолжаются в дистальные канальцы, которые в краниальной части первичной почки открываются в вольфов проток, в каудальной части с вольфовым протоком не взаимодействуют. Начальный участок проксимальных канальцев взаимодействует с кровеносным капилляром. В месте взаимодействия с капилляром наблюдаются многочисленные апоптозные тельца, эпителий разрыхлен. Подобный васкуло-проксимотубулярный контакт можно идентифицировать как гомолог мезоне-фрального тельца и филогенетическую стадию образования почечного тельца окончательной почки у млекопитающих.

Рис. 1. Первичная почка зародыша сирийского хомяка, 13-я стадия, 9 сут 6 ч рс:

1 – первичная почка, 1.1 – мезонефральный проток;

1.2 – мезонефральные канальцы.

Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: об. 10, ок 5.

Рис. 2. Первичная почка зародыша сирийского хомяка, 14-я стадия, 9 сут 12 ч рс:

1 – первичная почка, 1.1 – проксимальный каналец.

Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: об. 40, ок 5.

В течение 14-й стадии продолжается формирование гомологов мезонефральных телец. На 16-й стадии мезонефральные канальцы приобретают S-образную форму, что можно расценивать как структурный признак дифференцировки органа. В начале 18-й стадии развитии наиболее дифференцированные мезонефроны располагаются в краниальном и среднем отделах мезонефроса.

При морфометрии первичной почки получены количественные данные, характеризующие структурно-функциональное состояние проксимальных мезонефральных канальцев в первичной почке в динамике эмбриогенеза (таблица, рис. 3).

Результаты морфометрии проксимальных мезонефральных канальцев

Стадия развития рс	Возраст эмбриона, (сут/ч)	Площадь канальца			Площадь просвета канальца			Площадь эпителия
		Х ± Sх (мкм²)	р	% прироста	Х ± Sх (мкм²)	р	% прироста	Х ± Sх (мкм²)	р	% прироста
13	9/6	358,34 ± 8,32			8,36 ± 0,24			349,98 ± 8,15
14	9/12	٭9,33 ± 374,14	< 0,001	4,41	٭0,15 ± 5,12	< 0,001	–38,76	369,02 ± 9,22	0,128	5,44
	9/18	٭0,28 ± 393,12	< 0,001	5,07	5,11 ± 0,14	0,517	–0,20	٭0,19 ± 388,01	< 0,001	5,14
15	10/0	٭ 0,21 ± 366,41	< 0,001	–6,79	5,40 ± 0,19	0,019	5,68	٭0,19 ± 361,01	< 0,001	–6,96
	10/6	٭ 6,23 ± 321,13	< 0,001	–12,36	6,95 ± 0,22	0,002	28,70	٭6,39 ± 314,18	< 0,001	–12,97
16	10/12	٭4,73 ± 241,43	< 0,001	–24,82	٭0,32 ± 9,75	< 0,001	39,14	٭4,66 ± 231,68	< 0,001	–26,26
	10/18	٭3,27 ± 187,60	< 0,001	–22,30	8,73 ± 0,34	0,008	–9,72	٭2,97 ± 178,87	< 0,001	–22,18
17	11/0	٭2,04 ± 162,30	< 0,001	–13,49	٭0,27 ± 8,60	< 0,001	–1,49	٭1,65 ± 153,70	< 0,001	–14,07
	11/6	٭1,68 ± 147,34	< 0,001	–9,22	٭0,28 ± 7,37	< 0,001	–14,30	٭1,40 ± 139,97	< 0,001	–8,93
	11/12	٭1,94 ± 164,16	< 0,001	11,42	٭0,29 ± 8,99	< 0,001	21,98	٭1,64 ± 155,17	< 0,001	10,86
	11/18	160,23 ± 1,91	0,069	–2,39	8,64 ± 0,23	0,162	–3,89	٭1,52 ± 151,59	< 0,001	–2,31
18	12/0	161,08 ± 1,47	0,943	0,53	٭0,32 ± 4,63	< 0,001	–46,41	٭1,22 ± 156,45	< 0,001	3,21
	12/6	155,42 ± 1,48	0,152	–3,51	4,57 ± 0,26	0,870	–1,30	150,85 ± 1,23	0,006	–3,59
19	12/12	158,44 ± 1,65	0,152	1,94	5,47 ± 0,30	0,005	19,69	152,97 ± 1,58	0,297	1,41
	12/18	156,84 ± 2,10	0,699	–1,01	4,86 ± 0,25	0,179	–11,15	151,98 ± 1,99	0,894	–0,64
20	13/0	٭1,98 ± 146,41	< 0,001	–6,65	4,61 ± 0,31	0,247	–5,14	٭1,87 ± 141,80	< 0,001	–6,70
	13/6	141,14 ± 1,81	0,271	–3,60	٭0,19 ± 5,04	< 0,001	9,33	136,10 ± 1,63	0,009	–4,03

٭ Изменение статистически значимо в сравнении с показателем предыдущего срока эмбриогенеза ( ٭ р ≤ 0,05).

Возраст эмбриона, сут./часы

Рис. 3. Динамика показателей площадей проксимальных мезонефральных канальцев, просвета канальцев и эпителия в эмбриогенезе у сирийских хомяков

В результате морфометрического исследования с 13 по 16-ю стадии эмбрионального развития при разнонаправленности изменений показателей происходит существенное уменьшение величины или существенное уменьшение средней площади сечения канальцев с 358,34 ± 8,32 до 187,60 ± 3,27 мкм², а также площади эпителия с 349,98 ± 8,15 до 178,87 ±2,97 мкм². При этом увеличивается средняя площадь просвета канальцев с 8,36 ± 0,24 до 8,73 ± 0,34 мкм².

Уменьшение средних показателей площади сечения, площади эпителия и увеличение площади просвета сопровождается уменьшением доли эпителия и увеличением доли просвета от средней площади сечения канальцев. Средние доли эпителия и просвета с 9 сут 6 ч до 11 сут составили 98,1; 1,9 %, соответственно.

17-я стадия развития характеризуется относительной стабильностью показателей, что в большей степени относится к средней площади просвета канальцев. Средняя площадь просвета на 17-й стадии имеет показатель 8,60 ± 0,28 мкм², при увеличении на 20,81 %. Средняя площадь канальцев сечения в течение 17-й стадии развития снижается на 55,46 % и составляет 162,30 ± 2,04 мкм², площадь эпителия также снизилась на 57,02 %, в результате – 153,70 ± 1,77 мкм². На 17-й стадии доля площади просвета сохраняется на максимальном уровне для всего срока наблюдения и в среднем имеет показатель 5,1 %, доля эпителия сохранилась на минимальном уровне для всего срока – 94,9 %

Морфометрические показатели с 18 по 20-ю стадии развития характеризуется тем, что происходит постепенное незначительное уменьшение. Так, площадь эпителия уменьшается на 1,62 % и достигает показателя 130,61 ± 1,58 мкм²; площадь сечения канальцев уменьшается на 4,39 % площади и достигает 134,42 ± 1,69 мкм². Величина просвета существенно уменьшается на 54 %, достигая 3,95 ± 0,22 мкм², что сопровождается существенным уменьшением доли просвета на 3,18 % и существенным увеличением доли эпителия на 96,82 %.

Закл ючение

Сравнительный анализ показателей морфометрии проксимальных канальцев в абсолютных и относительных величинах позволяет выделить три этапа в течение срока существования первичной почки.

I этап продолжается с 9 сут 6 ч рс до 10 сут 18 ч рс (13–16-я стадии), II этап – 11 сут 00 ч – 11 сут 18 ч (17-я стадия), III этап – 12 сут 00 ч – 13 сут 06 ч (18–20-я стадии).

I этап – этап формирования мезонефральных канальцев, для них характерны максимальные размеры с постепенным уменьшением к стадии функциональной активности.

II – этап функционального «расцвета». В соответствии с последней эмбриологической терминологией проксимальный мезонефральный каналец также обозначен термином «секреторный». Наличие выраженных васкуло-проксимотубулярных контактов, секреторной активности и максимальной величины просвета свидетельствует о функциональной активности этого сегмента мезонефрона.

• III этап характеризуется завершением срока существования первичной почки.