Мультиплексная ПЦР для индикации и дифференциации возбудителей респираторных вирусных инфекций крупного рогатого скота

Ведущее место среди заболеваний телят занимает патология респираторного тракта. Инфекции респираторного тракта ведут к формированию хронической бронхолегочной патологии у крупного рогатого скота (КРС). Поиск причин рецидивирова-ния существенно затрудняет широкий этиологический спектр острых респираторных вирусных инфекций крупного рогатого скота (ОРВИ КРС). В числе вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания, отмечают респираторносинцитиальный вирус, вирусы парагриппа, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи-болезни слизистых, бактериальные инфекции [1].

Болезни легких инфекционной этиологии наиболее распространены и являются одной из ведущих причин гибели животных. Они остаются единственным видом патологии, гибель от которого не только не снижается, но и продолжает расти. По прогнозам ветеринарных специалистов, к 2020 году болезни органов дыхания войдут в тройку лидеров по показателям гибели животных [6].

Наиболее значимыми из группы респираторных болезней являются инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3) и вирусная диарея (ВД). В современном промышленном скотоводстве наиболее эффективным способом профилактики респираторных инфекций крупного рогатого скота считается вакцинация

Ведущую роль в возникновении респираторных болезней играют вирусы инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС), вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС). По данным большинства исследователей, респираторные болезни регистрируют в основном у молодняка КРС в возрасте 1-6 месяцев. [7].

Респираторные болезни являются важной причиной экономического ущерба в молочном скотоводстве. Они приводят к падежу животных или снижению скорости их роста, увеличению затрат на лечение, диагностические и профилактические мероприятия [2].

Тяжесть их проявления варьирует от острых клинических форм, приводящих к летальному исходу, до субклинических или бессимптомных, сопровождающихся снижением показателей продуктивности у переболевших животных [8].

Для подтверждения диагноза на эти инфекции используются специфические лабораторно-инструментальные методы исследования: выделение вирусов и токсинов (цитопатическое действие на культуру клеток); серологическая диагностика и полимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амплификация.

Недостаток при выделении вирусов на культуре клеток (низкая чувствительность, не всегда можно по цитопатическо- му действию (ЦПД) точно определить вид вируса, ЦПД может и не быть, большие трудности связаны с контаминацией культуры клеток другими биопатогенами и сапрофитными организмами) [5].

Недостаток серологической диагностики (низкая чувствительность (РА, ПР, РСК), низкая специфичность (ИФА с цельным вирусным антигеном), не всегда есть возможность дифференциации вакцинного иммунитета от патологического процесса) [3].

Индикация респираторных заболеваний крупного рогатого скота - долгий и трудоемкий процесс, а на практике зачастую требуется быстрое и точное определение биопатогена циркулирующего в хозяйстве, чтобы своевременно предпринять меры по профилактике и лечению возникшей болезни. Наиболее точным и быстрым методом диагностики является ПЦР, особенно при одновременной амплификации нескольких маркерных областей.

С учетом изложенного целью настоящей работы являлось изыскание олигонуклеотидных праймеров для одновременной индикации и дифференциации геномов возбудителей, наиболее часто регистрируемых респираторных вирусных инфекций мультиплексной полимеразноцепной реакцией.

Материал и методы исследований. Подбор праймеров и зондов для ге-ноиндикации пользовались ресурсами национального центра биологической информатизации (NCBI), BLAST и программой VectorNTI 9.1.0. (Invitrogen Corporation). Выделение ДНК для положительного контроля не требуется, перед ПЦР положительный контроль разбавяли в 100000 раз. С целью применения в мультиплексной ПЦР сконструировали уникальный положительный контроль, содержащую комплиментарную нуклеотидную последовательность ко всем олигонуклиотидным затравкам искомых вирусов.

Результаты исследований. Для оценки генетического полиморфизма и выявления консервативных участков геномов возбудителей инфекционного рино- трахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи крупного рогатого скота был создан собственный банк геномов, включающий от 7 до 14 изолятов каждого вида вируса. Путем выравнивания олигонуклеотидных последовательностей геномов каждого из исследуемых вирусов установлены консервативные участки соответствующих геномов. У вируса возбудителя инфекционного ри-нотрахеита в геноме HV тип 1 штамм Cooper консервативный локус находится на участке 4716 - 4846 bp. У вируса парагриппа-3, изолят Egypt2014 консервативный локус находится в зоне 2820-2910 bp. У возбудителя вирусной диареи, изолят Carlito консервативный локус выявлялся на участке 84-204 bp. Установление последовательностей локусов актуальна для варианта «Consensus» при выравнивании нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидные последовательности наиболее перспективных в плане специфичности локусов геномов приведены в таблице 1.

С учетом выявленных данных созданы праймеры и зонды для амплификации последовательностей в рамках вышеуказанных консервативных локусов, которые представлены в таблице 2. Одновременно с подбором праймеров был создан и зонд для возможного использования в качестве внутреннего контроля амплификации последовательности гена каппа-казеина.

Опытным путем была установлена оптимальная температура отжига для всех праймеров которая составляла 56 °С, что позволяет реализовывать возможность сочетания тест-систем в мультиплексном формате. Для контроля амплификации (в качестве положительного контроля) был произведен дизайн и синтез кольцевых молекул ДНК (плазмид), включающих в себя амплифицируемые последовательности ДНК. На основе экспериментальных данных разработана реакционная смесь и условия проведения реакции, обеспечивающие эффективное накопление продуктов амплификации для всех исследуемых видов вирусов приведены в таблице 3 и 4 соответственно

Таблица 1 – Маркерные участки геномов вирусов

Вирус	Консервативный локус
Парагрипп-3	acaaguaagaaaaacuuaggauuaacgggaauuauccaauccggagac-ggagggacaaauccagaauccacccacgaccaaccaaaccaaagauucaug-gaaaacaaugcuaaagacaaucaaaucauggauucuugggaagagggaucaggaga-caagucaucugacaucucaucggcccucgacauc
Вирусная диарея	agcgaaggccgaaaagaggcuagccaugcccuuaguaggacuag- caaaacaaggaggguagcaacaguggugaguucguuggauggcugaagcccugagua-caggguagucgucagugguucgacgcuuugugcgacaagccucgagaugccacgug-gacgagggcaugcccacagcacaucuua
Инфекционный ринотрахеит	ctgtgcccgtgcgtgtagacaggcaagtagcggctcatggcctcggcgacgatgccctt-gagcgtgggg

Таблица 2 – Нуклеотидная последовательность разработанных праймеров и зондов для генетической идентификации возбудителей вирусных респираторных заболеваний КРС (ИРТ, ПГ-3, ВД-БС).

Название	Последовательность 5` -› 3`
BPG1F	ttcccaagaatccatgatttgatagt
BPG1R	aacaaataagaaaaacttaggattaacgga
BPG1P	Fam-atgtcgagggccgatgagatgtcagatg-BHQ1
BPG2F	cagaaagggcgattacattattacaga
BPG2R	tcttcgatgcagtatccgcatt
BPG2P	Fam-cattcgccacacacacaactctcttgtcttg-BHQ1
BVD1F	cgaaggccgaaaagaggcta
BVD1R	cgaaccactgacgactaccctg
BVD1P	R6G-agtggtgagttcgttggatggctgaag-BHQ2
BVD2F	agcggcggagcatgtggat
BVD2R	cacacaggccacaagggaacg
BVD2P	CY5-cgatgcaacgcgaagaaccttacctggg- BHQ3
BHV1F	ctgtgcccgtgcgtgtagac
BHV1R	cccacgctcaagggcatc
BHV1P	CY5-tagcggctcatggcctcggcg-BHQ3
BHV2F	aggctgtcggcaggacga
BHV2R	tgcggctgcccgtagc
BHV2P	CY5-ccaaacacgtagggcgcggcag-BHQ3
BkapF	cttggcaggcacagtatttgaca
BkapR	attactaccaacagaaaccagttgcac
BkapP	CY5-ttgaagaatttgggcaggtgacctaactg-BHQ3

Таблица 3 – Реакционная смесь, в расчёте на одну пробирку

Компонент	Количество, мкл
dNTP	1,5
10 Х ПЦР буфер Б	1,5
Syn Taq ДНК-полимераза	0,5
MgCl 2	1,5
dd H2O	3,5
флуоресцентный зонд (типа Taq Man), 10 пкмоль/мкл	0,5
смесь праймеров, 10 пкмоль/мкл	Каждого по 0,5
MMLV ревертаза	0,2
Образец ДНК	5

Таблица 4 – Условия проведения ПЦР состояли из следующих этапов

1.	37°С	30 мин
2.	95°С	5 мин
3.	95°С	5 сек
4.	56°С	30 сек, детекция, переход на шаг №3 (40 повторов)

Опытным путем определяли режим и пропорциональный состав ПЦР тест-систем, для индикации каждого из выявляемых биопатогенов методом одиночной ПЦР и в режиме реального времени с одновременной обратной транскрипцией вирусной РНК, в той же реакционной смеси были одинаковы.

Чувствительность тест-систем определялась путем десятикратных разведений препарата плазмидной ДНК для индикации возбудителей вирусной диареи КРС, инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3. Стабильная амплификация наблюдалась при разведении 1:10-10, что составило 1 геном-эквивалент на 0,1 мкл плазмидной ДНК.

Основываясь на результате созданных испытаний моно-тест-систем для индикации вирусов ИРТ, ВД, ПГ-3 было выявлено, что максимальной эффективностью амплификации ДНК мишени обеспечивают следующие комплексы олигонук- леотидных затравок: BPG32; BVDV1 и BHV11.

Установленное экспериментом наиболее эффективное соотношение оли-гонуклеотидных затравок для выявления каждого из искомых вирусов, приведено в таблице 6.

В установленную реакционную смесь вводится 5 мкл препарата искомых нуклеиновых кислот. Условия проведения ПЦР были те же, что и для одиночной ПЦР.

В результате проведенных опытов установлена специфическая амплификация целевых праймеров на ДНК-матрице положительного контрольного образца в мультипраймерной реакционной смеси (в качестве ДНК-матрицы выступают нуклеиновые кислоты на каждый из искомых возбудителей).

Результаты амплификации представлены на рисунке 1.

Таблица 6 – Соотношение количества олигонуклеотидных затравок для амплификации

ДНК-матриц респираторных вирусов крупного рогатого скота в мультиплексном варианте

Наименование инфекции Прямой праймер, мкл Обратный праймер, мкл Зонд, мкл вирусная диарея КРС 0,2 0,2 0,3 парагрипп – 3 0,3 0,3 0,4 инфекционный ринотрахеит 0,3 0,3 0,4 матрицы использована ДНК вируса инфекционного ринотрахеита; 3 - мультиплексная реакционная смесь, в качестве ДНК-матрицы использована плазмидная ДНК со вставкой специфичного локуса для вирусной диареи КРС.

Рисунок 1 – Амплификация ДНК-маркеров легочных вирусов респираторных инфекций крупного рогатого скота в режиме реального времени. Обозначения: 1 –мультиплексная реакционная смесь, содержащая ДНК-матрицы плазмидной ДНК со вставкой специфичного для вируса локуса парагриппа-3; 2- мультиплексная реакционная смесь, в качестве ДНК-

Каждому биологическому патогену соответствовала индивидуальная флуоресцентная метка. В частности, для возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота – канал R6G, для вируса парагриппа-3- канал Fam, и для вируса инфекционного ринотрахеита Cy5. Таким образом разработана технология и режим ПЦР в реальном времени, позволяющие обнаруживать одновременно все 3 генома возбудителя.

Полимеразно-цепная реакция показала, что смесь отобранных олигонуклео-тидных затравок при взаимодействии с одними ДНК-маркерами не препятствует накоплению продуктов амплификации специфических локусов.

Заключение. В результате проведенных исследований определены маркерные локусы генотипов возбудителей ПГ-3, ВД, ИРТ. Изысканы праймеры и зонды, оптимизированы условия и режим мультиплексной ПЦР локусов их геномов. При амплификации исследуемых образцов нуклеиновых кислот в мультиплексной ПЦР в реальном времени доказана возможность одновременной индикации и дифференциации геномов возбудителей ПГ3, ВД, ИРТ.