Мультирезистентные штаммы туберкулеза с этническим разнообразием в Республике Бурятия

Республика Бурятия представляет собой территорию на Дальнем Востоке, характеризующуюся показателем заболеваемости туберкулезом со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) и полиэтническим составом населения (30% ― буряты монголоидного происхождения, 65% ― представители русского этноса). Двести изолятов M. tuberculosis, полученных от впервые выявленных пациентов, прошли комплексное фенотипическое тестирование и молекулярно-генетическое типирование. Генотип Beijing более часто встречался в русской популяции по сравнению с бурятской (68% против 53%; P = 0,055). Европейские генетические линии, не относящиеся к Beijing (LAM, Ural, Haarlem), обнаруживались у бурят с двукратно большей частотой ― 39,5%.

Высокая распространенность Beijing среди лиц, имевших пенитенциарный анамнез (79% против 61% в общей группе пациентов, P = 0,1), свидетельствует об его усиленных трансмиссивных характеристиках. Российский эпидемический кластер B0/W148 составил 9,5%, что вдвое ниже показателей других сибирских регионов. Гипервирулентный кластер Beijing 14717-15 являлся эндемичным для Бурятии, однако парадоксальным образом чаще изолировался от пациентов русской национальности по сравнению с бурятами (9,1% против 3,9%; P = 0,2). Пекинские сублинии B0/W148, CAO и 14717-15 показали статистически значимую ассоциацию с мультирезистентностью (P = 0,01–0,0001). ВИЧ-коинфекция регистрировалась достоверно чаще у русских пациентов: 141 (24,8%) против 551 (9,8%) у бурят, P = 0,03. Таким образом, популяционная структура M. tuberculosis в Бурятии сохраняет специфические особенности относительно других российских регионов и принципиально отличается от таковой в сопредельной Монголии. Циркуляция пекинских субтипов с высоким уровнем МЛУ и непекинских штаммов, вызывающих лекарственную резистентность, указывает на риск их дальнейшей экспансии.

Индивидуальная предрасположенность к инфицированию M. tuberculosis и прогрессированию в активную форму заболевания определяется комплексом факторов, среди которых генетические характеристики человека-хозяина играют существенную, хотя и не абсолютную роль. У взрослой популяции эта зависимость реализуется через слабое взаимодействие множественных генетических локусов и может определяться коадаптационными процессами между M. tuberculosis и человеческими популяциями [2; 11; 13]. Более того, неравномерное распределение определенных генотипов M. tuberculosis в различных этнических группах может объясняться как генетическими особенностями хозяина, так и социокультурными факторами, включая образ жизни [15]. Буряты ― монгольская этническая группа, исторически происходящая из юго-восточных районов Сибири и использующая бурятский язык, в настоящее время представляют 30% населения Республики Бурятия ― дальневосточного российского региона, граничащего с Иркутской областью и озером Байкал на западе, а также с Монголией на юге. По данным 1926 г. эта доля достигала 44%, однако сократилась до 21% к 1939 г. и колебалась в пределах 20–25% Буря-тия#Демография). В этом контексте Бурятия представляет интерес для исследования взаимодействий патогена и хозяина на популяционном уровне с позиции этнического происхождения через сравнительный анализ монголоидной бурятской и европеоидной русской этнических групп.

Дальневосточный федеральный округ Российской Федерации характеризуется особенно неблагополучной эпидемиологической ситуацией по туберкулезу в отношении уровня заболеваемости, частоты коинфекции ТБ/ВИЧ и распространенности МЛУ-ТБ.

Регион демонстрирует общероссийские тенденции динамики туберкулеза. Показатель заболеваемости в Бурятии снизился со 168,0 в 2009 г. до 31,9 на 100 тысяч населения в 2024 г. Тем не менее лекарственно-резистентные штаммы продолжают распространяться, и пропорция МЛУ-штаммов среди МБТ-позитивных случаев возросла с 7,2% в 2009 г. до 18,6% в 2024 г. До этого исследователи охарактеризовали молекулярно-эпидемиологические аспекты туберкулеза в Бурятии на основе анализа изолятов, собранных в период 2010–2016 гг. [17] Было продемонстрировано высокое преобладание генотипа Beijing и присутствие российского эпидемического штамма B0/W148. Однако в отличие от сопредельных сибирских территорий значительная часть пекинских штаммов обладала интактной геномной областью RD181, идентифицируемых как ранний древний Beijing или AsiaAncestral 1; они характеризовались профилем Mlva 14717-15 и родственными профилями согласно международной номенклатуре. Кластеру Beijing 14717-15 характерны гипервирулентные свойства и высокая летальность в мышиной экспериментальной модели [1]. Он является эндемичным для Бурятии, крайне редко встречается в азиатских регионах России и полностью отсутствовал в европейской части страны и других государствах. По результатам полногеномного секвенирования глобального набора предковых Beijing-штаммов с интактным регионом RD181 «бурятский» кластер Beijing 14717-15 оказался филогенетически дистантным по отношению к изолятам корейского происхождения [10]. Было выдвинуто предположение о существовании специфических взаимодействий между системой иммунологической защиты организма человека и характерными генетическими особенностями рассматриваемого изолята [14].

В настоящей работе мы проанализировали современную ситуацию с циркулирующими штаммами M. tuberculosis в Бурятии и их клинически значимыми характеристиками, которые могут дифференцированно проявляться в различных этнических группах. Мы также стремились идентифицировать возможные трансформации в популяционной структуре M. tuberculosis, выявленной в Бурятии, других территориях азиатской части России и в географическом контексте Сибири, Дальнего Востока и Монголии.

Материалы и методы

Пациенты и штаммы M. tuberculosis

Проведено проспективное исследование, основанное на изучении всех изоля-тов M. tuberculosis от впервые выявленных больных туберкулезом в Республике Бурятия, которые ранее не получали противотуберкулезную терапию. В исследование включались все соответствующие критериям пациенты без предварительного отбора по половой принадлежности, возрасту, национальности, ВИЧ-статусу и другим параметрам. Пациенты являлись постоянными жителями Республики Бурятия.

Культивирование штаммов и их характеристика проводились стандартными бактериологическими и биохимическими методами в бактериологической лаборатории Клинического противотуберкулезного диспансера (РКПТД) города Улан-Удэ. Лаборатория функционирует как Региональный референс-центр по бактериологии M. tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий. Административно Бурятия разделена на 21 район; в 4 районах функционируют противотуберкулезные диспансеры, в 17 районах организованы пункты сбора диагностического материала на базе центральных районных больниц. Биологический материал собирается от всех пациентов с установленным либо предполагаемым туберкулезом, еженедельно направляется в центральную бактериологическую лабораторию РКПТД. Учреждения общей лечебной сети (поликлиники, стационары) также оснащены кабинетами для сбора мокроты и микроскопии по Цилю-Нильсену, все положительные образцы направляются в референс-лабораторию для подтверждения. Дополнительно, с целью контроля качества, 10% всех негативных мазков также направляются в референс-лабораторию.

Внешний контроль качества бактериологической лаборатории осуществляется через систему внешней оценки качества «Центр внешнего контроля качества клинических лабораторных исследований» (Москва, Российская Федерация).

Наличие ВИЧ-инфекции, клиническая форма заболевания и лекарственная резистентность изолятов M. tuberculosis были получены из медицинской документации, все персональные данные были деидентифицированы. Этническая принадлежность определялась методом самоидентификации.

Фенотипическая резистентность оценивалась к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этионамиду, этамбутолу, канамицину, парааминосалициловой кислоте (ПАСК), циклосерину, капреомицину, амикацину, левофлоксацину культуральными методами согласно регламентирующим документам Министерства здравоохранения Российской Федерации (приказы № 109 и 951). Определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к препаратам первого и вто рого ряда осуществлялось модифицированным методом пропорций на жидкой среде Middlebrook 7H9 и в системе Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson, Sparks, Md.) в соответствии с инструкциями производителя. Критические концентрации препаратов составляли: стрептомицин ― 1,0 мкг/мл, изониазид ― 0,1 мкг/мл, этамбутол ― 5,0 мкг/мл, рифампицин ― 1,0 мкг/мл, пиразинамид ― 100 мкг/мл, амикацин ― 1,0 мкг/мл, капреомицин ― 2,5 мкг/мл, офлоксацин ― 2,0 мкг/мл, этионамид ― 5 мкг/мл.

Фенотипические категории МЛУ, пре-ШЛУ и ШЛУ определялись согласно актуализированным дефинициям Всемирной организации здравоохранения: МЛУ ― штаммы, резистентные к изониазиду и рифампицину; пре-ШЛУ ― резистентные к изониазиду, рифампицину и любому фторхинолону; ШЛУ ― резистентные к изониазиду, рифампицину, фторхинолону плюс бедаквилин и/или линезолид. Штаммы, демонстрирующие резистентность к двум и более препаратам, но не соответствующие критериям МЛУ, классифицировались как полире-зистентные.

Молекулярно-генетическое типирование

Мы применяли разработанную ранее стратегию генотипирования основных эпидемиологически и/или клинически значимых генотипов, эпидемически распространенных в Российской Федерации [2; 12; 13; 15]. Экстракция ДНК M. tuberculosis проводилась согласно описанному стандартному протоколу [6]. На первом этапе штаммы дифференцировались на Beijing и non-Beijing на основании ПЦР-детекции, специфичной для генотипа Beijing инсерции IS6110 в регионе dnaA-dnaN [7]. Основные пекинские сублинии, распространенные в Российской Федерации в целом и Сибири в частности (кластер B0/W148, среднеазиатско-российский кластер, штамм 94-32-CAO, кластер 14717-15, кластер 107132), идентифицировались посредством ПЦР-ПДРФ или ПЦР в реальном времени по специфическим геномным локусам, как описано ранее [9; 10; 16].

Пекинские сублинии (древняя и современная) дифференцировались с помощью ПЦР в реальном времени локусов mutT2-58/mutT4-48 [1]. Непекинские штаммы подвергались сполиготипированию с последующим сравнительным анализом в базе данных SITVIT2 [4].

Статистический анализ осуществлялся с использованием онлайн-инструмента MedCalc Для выявления статистически значимых различий между группами применялся критерий хи-квадрат. Рассчитывались χ² с поправкой Йейтса и P-значения с 95%-ным доверительным интервалом. Порог статистической значимости устанавливался на уровне P = 0,05.

Результаты

Характеристика исследуемой когорты и структура генотипов M. tuberculosis

Исследуемая когорта включала 200 впервые диагностированных бациллярных больных туберкулезом. Преобладающее большинство пациентов составили мужчины (n=145), женщин было 55, то есть соотношение мужчин к женщинам составило 2,64. Средний возраст в общей когорте ― 44,8 ± 12,9 года, в группе мужчин ― 45,7 ± 10,6 года, в группе женщин ― 42,5 ± 16,7 года. Пациенты являлись постоянными жителями Бурятии, среди них незначительно преобладали городские жители. По этнической структуре 51 (25,5%) пациент был бурятом,

141 (70,5%) ― русским и 8 (4%) пациентов принадлежали к другим этническим группам (татары ― 6, украинцы ― 1, тувинцы ― 1). Это соответствует общей популяционной структуре Бурятии, где буряты и русские составляют 32,5 и 63,9% соответственно, по данным переписи 2021 г. ВИЧ-коинфекция была идентифицирована у 42 пациентов и достоверно чаще регистрировалась у русских по сравнению с бурятами: 35/141 (24,8%) против 5/51 (9,8%), P = 0,03.

Доминирующими клиническими формами являлись инфильтративный туберкулез (62,5%) и диссеминированный туберкулез легких (25,0%).

Большая часть изолятов демонстрировала лекарственную чувствительность (113/200; 56,5%), МЛУ идентифицирована у 46/200 (23,0%), 5 изолятов характеризовались пре-ШЛУ.

Все 200 образцов прошли генотипирование. Генотип Beijing определялся на первом этапе, затем идентифицировались его субтипы, все непекинские штаммы подвергались сполиготипированию.

В общей сложности 128 (64,0%) изолятов были классифицированы как пекинский генотип. Семьдесят два (36%) изолята отнесены к другим генотипам. Большинство пекинских штаммов принадлежало к кластеру 94–32 (n=85), далее следовали B0/W148 (n=19) и 14717-15 (n=15), еще 9 пекинских штаммов были отнесены к другим пекинским вариантам.

Дифференциация на крупные филогенетические подлинии генотипа Beijing показала, что древняя подлиния была представлена 15 штаммами кластера Beijing 14717-15, тогда как все остальные Beijing-штаммы принадлежали к современной подлинии.

По результатам сполиготипирования все 72 непекинских изолята принадлежали к линии 4 (евро-американская линия). Эти изоляты были представлены семействами LAM (n=30), Ural (n=8), Haarlem (n=11) и T (n=23).

Большинство T-штаммов (13/23) характеризовались сполиготипом SIT53, который является филогенетически предковым сполиготипом L4, и их штаммы могут принадлежать к различным сублиниям внутри L4. Семейство T, основанное на сполиготипировании, считается «слабо определенным» [3], и оно действительно не представляет истинного монофилетического клада, а включает различные группы по всей филогении линии 4 [5; 8]. Данные полногеномного секвенирования для этих штаммов были недоступны, и мы определили T-штаммы (n=23) как L4-неклассифицированные, следуя ранее использованной терминологии [17].

Сравнительный анализ генотипов M. tuberculosis

Мы провели сравнение генотипов и подтипов по лекарственной резистентности, возрастной структуре пациентов, месту проживания (городская/сельская местность), этнической принадлежности, пенитенциарному анамнезу, а также по диагнозу и клиническим формам туберкулеза.

Исследуемые генотипы и субтипы различались по уровню лекарственной резистентности. В целом пекинский генотип чаще демонстрировал полирезистент-ность/МЛУ по сравнению с непекинскими штаммами: 53/128 (41%) против 25/71 (35%), хотя это различие не достигло статистической значимости (P = 0,4). Однако при более детальном анализе крупных субтипов было выявлено три кластера, демонстрирующих сильную ассоциацию с МЛУ. B0/W148 и CAO (современный подтип) и 14717-15 (древний подтип) были ассоциированы с мультирезистентностью по сравнению с Beijing 94-32 (не-CAO) и не-Beijing (P = 0,01 – 0,0001).

Пациенты с инфильтративным и диссеминированным туберкулезом сформировали две наиболее многочисленные группы (125 и 52 пациента соответственно). Эти две группы различались по распределению генотипов, но незначительно. B0/W148 чаще встречался в группе диссеминированного туберкулеза (14% против 8,8%), 94–32 ― в группе инфильтративного туберкулеза (43,2% против 38%). Beijing 14717-15 также чаще регистрировался в группе инфильтративного туберкулеза (8,8% против 6%). LAM, Haarlem и Ural встречались в аналогичных пропорциях в обеих группах.

Двадцать четыре пациента имели пенитенциарный анамнез, и все три пекинских подтипа демонстрировали более высокую распространенность среди заключенных, хотя и незначительно. При объединении всех пекинских субтипов генотип Beijing был более распространен среди заключенных по сравнению с непекинскими штаммами: 79,2% против 61,2%, P = 0,1. Наиболее крупный непекинский генотип LAM демонстрировал более высокую распространенность среди пациентов без пенитенциарного анамнеза: 15,9% против 8,3%, P = 0,3. Аналогично, каждый из других непекинских генотипов (Haarlem, Ural и L4-неклассифицированные) также характеризовался более высокой частотой среди пациентов без пенитенциарного анамнеза.

Сравнение городских и сельских условий не выявило различий в распределении генотипов. Наиболее крупный субтип Beijing 94-32 демонстрировал лишь незначительное преобладание в сельской местности (45,4% против 39,6%).

Мы провели сравнение генетически различных этнических групп по распределению генотипов M. tuberculosis. При объединении пекинских подтипов и непекинских генотипов пекинские штаммы были значительно более распространены среди русских (68% против 32% непекинских). Напротив, у бурят пекинские и непекинские штаммы присутствовали в сопоставимых пропорциях ― 53% против 47%. При сравнении двух этнических групп пекинские штаммы демонстрировали более высокую распространенность среди русских по сравнению с бурятами: 68% против 53%, P = 0,055; соответственно, европейские непекинские типы (LAM, Ural, Haarlem) были в два раза больше распространены у бурят по сравнению с русскими: 39,2% против 20,5% (P = 0,01). Четко определенные семейства L4 (LAM, Ural, Haarlem) демонстрировали более высокую распространенность у бурят: особенно Ural, 9,8% против 2,0% (P = 0,02) и LAM, 21,6% против 12,7% (P = 0,1).

Мы сравнили три возрастные группы, условно обозначенные как молодые (<36 лет), средние (36–59 лет) и пожилые (>59 лет). У бурят и русских наблюдалось сходное возрастное распределение, за исключением группы «пожилые» (19,6% бурят против 12,8% русских). Пациенты возрастной группы 36–59 лет составляли аналогичный процент (~60%) в обеих этнических группах.

Структура генотипов M. tuberculosis и их характеристики резистентности достоверно не различались между ВИЧ-негативной группой и группой пациентов с ВИЧ-коинфекцией. Единственное различие касалось генотипа Ural, который был выявлен исключительно у штаммов из ВИЧ-негативной группы (P = 0,0007). Независимо от генотипа штаммы с МЛУ и полирезистентностью демонстрировали более высокую распространенность среди ВИЧ-коинфицированных пациентов по сравнению с ВИЧ-негативными (21/42; 50% против 57/158; 36%), но не достигая статистической значимости, P = 0,1.

Обсуждение

Эпидемиология туберкулеза в Бурятии детерминируется множеством факторов, в частности, реализацией программ противотуберкулезного контроля, этническим составом с существенной долей нерусского населения, а также взаимодействием с сопредельными территориями как внутри России, так и за ее пределами.

Данное исследование показало, что общая популяционная структура M. tuberculosis и тенденции лекарственной резистентности в Бурятии в основном соответствуют таковым в других российских регионах: все штаммы относятся либо к L2 (восточноазиатская линия), либо к L4 (евроамериканская линия), а уровень распространенности МЛУ-штаммов среди впервые выявленных случаев вызывает серьезную тревогу (23%). Вместе с тем были идентифицированы некоторые специфические для Бурятии особенности.

Для идентификации возможных динамических трансформаций в популяционной структуре мы провели сравнение полученных результатов по распределению генотипов с предшествующими исследованиями в Бурятии десятилетней давности, другими регионами России и сопредельной Монголией [6; 8; 10]. Проведенное исследование включало все последовательно отобранные изоляты от впервые выявленных пациентов на протяжении годичного периода. В отличие от этого, предшествующее исследование включало изоляты, собранные в течение трех месяцев в 2010, 2012 и 2016 гг., причем половина пациентов ранее получала лечение [17]. Это объясняет, почему МЛУ-ассоциированные (и, вероятно, характеризующиеся более длительными сроками лечения) штаммы Beijing B0/W148, Beijing 14717-15 и уральские штаммы демонстрировали более высокую распространенность в предшествующем исследовании в Бурятии. Что касается непекинских генотипов, наиболее крупный из них ― LAM ― не изменил свою распространенность, тогда как Ural и Haarlem продемонстрировали некоторые колебания, но статистически незначимые. Мы также подтвердили существенные контрастные различия в структуре генотипов Beijing между Бурятией и Монголией. Специфический для Китая подтип Beijing AA2 доминирует в Монголии, а присутствие генотипов LAM и Haarlem является единственной общей характеристикой между Монголией и Бурятией. В то время как LAM-RUS представляет историческую ветвь LAM, эндемичную в северной Евразии [17], штаммы Haarlem могли быть интродуцированы в Монголию и Бурятию в недавнее время из Китая и России соответственно.

В целом пекинский генотип широко распространен в азиатской части Российской Федерации, например в Бурятии (64%, данное исследование), Иркутске (71%) и Омске (67%), но демонстрирует несколько меньшую распространенность на северо-западе европейской части России, например в Вологде (64%), Мурманске (52%) и Карелии (54%) [6; 8; 10]. Однако при стратификации данных по этнической принадлежности следует отметить, что генотип Beijing в Бурятии встречался в меньшем проценте у бурят по сравнению с русскими (53% против 68%, P = 0,058) и по сравнению с другими регионами России с преимущественно русским (европеоидным) населением, например с сопредельной Иркутской областью (72,5%).

Заключение

В проведенном исследовании представлены новые данные о текущей эпидемии туберкулеза в Бурятии, регионе с высоким бременем МЛУ-ТБ. Изучение впервые выявленных больных позволило оценить активно циркулирующие штаммы M. tuberculosis. Молекулярная эпидемиология туберкулеза в Бурятии характеризуется относительно более низкой распространенностью генотипа Beijing по сравнению с другими регионами азиатской части России. Более того, среди бурят генотип Beijing регистрировался еще реже по сравнению с русскими. Уникальный гипервирулентный и высоколетальный (в мышиной экспериментальной модели) пекинский кластер 14717-15 являлся эндемичным в Бурятии, но чаще изолировался от русских по сравнению с бурятами (8,7% против 3,9%), кроме того, он не был идентифицирован у бурят старше 40 лет. Можно предположить, что Beijing 14717-15 не демонстрирует особенной патогенности для бурят после гипотетической длительной коадаптации к этой этнической группе. Эти предположения требуют экспериментальной верификации, например, на модели ex vivo.

Хотя за последние 10–15 лет популяционная структура M. tuberculosis в Бурятии не претерпела существенных трансформаций, она сохранила уникальные особенности по сравнению с другими регионами Сибири и европейской частью Российской Федерации, прежде всего эндемическое преобладание кластера Beijing 14717-15. Недавно было продемонстрировано, что этот штамм характеризуется наиболее высокой летальностью по сравнению с другими российскими штаммами в мышиной модели экспериментального туберкулеза, даже при условии получения инфицированными животными адекватной и продолжительной терапии. Также следует отметить, что в то время как Beijing B0/W148 широко распространен в Сибири (~20%) [6; 8], в Бурятии он регистрируется в два раза реже ― 9,5%. Популяционная структура M. tuberculosis в Бурятии принципиально отличается от таковой в сопредельной Монголии. Присутствие генотипов LAM и Haarlem представляет единственную общую характеристику между Монголией и Бурятией.

Уровень МЛУ среди изученной коллекции был высоким (23%) и соответствовал имеющимся эпидемиологическим данным. Вызывает обеспокоенность тот факт, что хотя МЛУ была особенно ассоциирована с тремя генотипами (Beijing B0/W148, Beijing 14717-15 и Beijing CAO), большинство других непекинских штаммов (LAM, Ural и T) также включали существенную долю лекарственно-резистентных вариантов.

С практической точки зрения проведенное исследование подчеркивает важность непрерывного мониторинга всех штаммов M. tuberculosis с особым акцентом на идентификации наиболее эпидемиологически значимых подтипов. Молекулярные маркеры этих подтипов должны быть интегрированы в состав коммерческих диагностических и генотипирующих панелей как компонент национальной программы противотуберкулезного контроля.