Мутации в генах rpoB, katG, inhA и ahpC в штаммах М. tuberculosis, циркулирующих в Кыргызской Республике

E-mail: jainagul@mail.ru

МУТАЦИИ В ГЕНАХ rpoB, katG, inhA И ahpC В ШТАММАХ М. TUBERCULOSIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ

Институт молекулярной биологии и медицины при Национальном центре кардиологии и терапии, Бишкек, Кыргызстан

Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (Multidrug-resistant – MDR TB) – это наиболее опасная форма туберкулеза, при которой туберкулезные микобактерии (МБТ) становятся устойчивыми как минимум к двум наиболее важным противотуберкулезным препаратам – изониазиду и рифампицину [1].

Установлено, что устойчивость МБТ к рифампицину (RIF) и изониазиду (INH) обусловлена мутациями в генах rpoB, katG, inhA и ahpC [2].

В настоящее время в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Москва, Россия) создан олигонуклеотидный «ТБ-Биочип», позволяющий выявить дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) МБТ и параллельно регистрировать мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC, ассоциированные с устойчивостью МБТ к RIF и INH, в течение двух дней [3].

Тип и частота встречаемости определенных мутаций в генах rpoB, katG, inhA и ahpC достаточно стабильны среди микобактериальных штаммов, распространенных в различных географических районах. В то же время, в ряде исследований была отмечена и определенная географическая вариабельность таких мутаций [4].

Целью настоящей работы было охарактеризовать мутации в генах rpoB, katG, inhA и ahpC в штаммах М. tuberculosis, циркулирующих в Кыргызской Республике.

Всего обследовано 445 впервые выявленных больных с клинически подтвержденным диагнозом легочного туберкулеза. Среди обследованных мужчин было 249 (60%), женщин – 196 (44%).

Всем больным помимо традиционных методов диагностики туберкулеза (рентгенография органов грудной клетки, микроскопии мазка мокроты, посев мокроты на выделение МБТ) на базе Института молекулярной биологии и медицины проводилась биочип-диагностика лекарственной устойчивости

МБТ к рифампицину и изониазиду. Образцы мокроты для исследования собраны согласно общепринятым методикам [5].

Микобактерии туберкулёза были обнаружены методом микроскопии при поступлении в клинику у всех 445 пациентов. Бактериологические исследования культур МБТ на чувствительность к противотуберкулёзным препаратам первого ряда проводили методом абсолютных концентраций [6]. В 445 случаях определение устойчивости МБТ к RIF и INH проводили тест-системой «ТБ-Биочип MDR», разработанной в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) [2]. Исследование на биочипах заключалось в выделении ДНК МБТ из мокроты, проведении двух последовательных мультиплексных ПЦР со специфическими для IS6110, rpoB, katG, inhA и ahpC праймерами, гибридизации продуктов амплификации второй стадии ПЦР с оли-гонуклеотидными зондами, установленными в ячейках биочипа. Результаты гибридизации регистрировали на портативном анализаторе биочипов «Чипде-тектор-03» (ООО «Биочип–ИМБ», Россия) с соответствующим программным обеспечением «Imageware». Сопоставляя полученный флуоресцентный образец со схемой расположения олигонуклеотидов на микрочипе, определяли мутации, присутствующие в изучаемой последовательности ДНК, и делали заключение об устойчивости или чувствительности исследуемого образца к рифампицину или к изониазиду.

Мутации в генах rpoB, katG, inhA, ahpC выявляли на биочипах и при отсутствии мутаций относили к чувствительным к RIF и INH, при наличии мутаций – к устойчивым к RIF или INH.

По результатам биочип-анализа у 47,4% (211 из 445) больных выявлены чувствительные к RIF и INH штаммы МБТ. Мутации в генах rpoB, katG, inhA и ahpC были выявлены у 53,2% больных. Первичная устойчивость только к изониазиду определена в 20% (88 из 445), 2,5% (11 из 445) больных имели первичную устойчивость только к рифампицину. МБТ с множественной лекарственной устойчивостью выявлены у 30,3% (135 из 445) больных.

Таким образом, по результатам биочип-анализа в структуре лекарственной устойчивости отмечался высокий удельный вес штаммов МБТ с МЛУ.

Устойчивость к рифампицину в 95% случаев связана с мутациями в гене rpoB. Известно более 40 типов мутаций в этом гене, обусловливающих резистентность к рифампицину. В основном они сосредоточены в коротком сегменте гена rpoB, состоящем из 81 пар основания и кодирующем аминокислоты 507-533 позиций.

Анализ спектра мутаций гена в rpoB 146 рифам-пицин-резистентных образцов МБТ показал, что чаще всего точечные мутации встречались в 531 (58%), в 526 (18%), в 516 (9%), 511 (6,8%) и в 533 (6%) 89

кодонах. Мутации в 522-м и 512-м кодонах встречались с частотой от 0,7% до 1,4% (табл. 1).

Таким образом, у больных туберкулезом, проживающих в Кыргызской Республике, устойчивость МБТ к рифампицину чаще всего обусловлена мутациями в 531-м, 526-м и 516-м кодонах гена rpoB. Основной причиной устойчивости МБТ к рифампицину является мутация Ser531 ^ Leu.

Таблица 1

Мутации гена rpoB M. tuberculosis, обусловливающие устойчивость к рифампицину

Кодоны гена rpoB	Аминокислотные замены	Нуклеотидные замены	Число образцов с мутациями
			абс.	(%)
531	Ser → Leu	TCG → TTG	81	56
	Ser → Trp	TCG → TGG	3	2
526	His → Arg	CAC → CGC	6	4
	His → Asp	CAC → GAC	6	4
	His → Tyr	CAC → TAC	6	4
	His → Leu	CAC → CTC	6	4
	His → Pro	CAC → CCC	1	0,7
	His → Asn	CAC → AAC	2	1,4
516	Asp → Tyr	GAC → TAC	11	7,6
	Asp → Val	GAC → GTC	2	1,4
511	Leu → Pro	CTG → CCG	10	6,8
533	Leu → Pro	CTG → CCG	9	6
512	Ser → Thr	AGC → ACC	2	1,4
522	Ser → Leu	TCG → TTG	1	0,7
Всего			146	100

Анализ литературных данных показывает, что во всем мире наиболее распространены штаммы МБТ с мутацией в трех кодонах (531, 526 и 516). Однако частота их встречаемости в разных странах разная. В странах бывшего Советского Союза, Ближнего Востока и Юго-Восточной Азии штаммы МБТ с мутацией в 531-м кодоне (Ser531 ^ Leu) встречаются гораздо чаще и составляют 50-70% [6, 7]. В Европейских странах частота встречаемости штаммов МБТ с мутацией Ser531 ^ Leu ниже и составляет 30-50% [8, 9].

Устойчивость МБТ к изониазиду ассоциирована с мутациями в нескольких генах, основными из которых являются: katG, inhA, и ahpC.

Среди 223 изониазид-резистентных штаммов мутации гена katG встречались в 90,5% случаев, inhA – в 9,05% и ahpC – в 0,45% случаев (табл. 2). В гене katG выявлено 4 различных типа мутаций: Ser315 ^ Thr встречалась в 88,7% случаев, Ser315 ^ Asn, Ser315 ^ Arg и Ser315 ^ Asn встречались в 0,45% случаев.

Мутации в генах inhA и ahpC выявлены в 9,05% и 0,45% случаев соответственно. В гене inhA обнаружены нуклеотидные замены в положении -15 и - 8 относительно сайта инициации трансляции (inhA T_15, inhA T_8). В промоторном участке гена ahpC мутации идентифицированы в положениях -9 относительно сайта инициации транскрипции (ahpC_9).

По литературным данным, штаммы МБТ с мутацией в 315-м кодоне гена katG обладают высокой устойчивостью к изониазиду и чаще регистрируются в странах с высокой распространенностью туберкулеза, таких как Латвия [10], Россия, Украина и Казахстан [11].

Таблица 2

Мутации в генах katG, inhA и ahpC M. tuberculosis, обусловливающие устойчивость к изониазиду

Гены	Кодоны	Аминокислотные замены	Нуклеотидные замены	Число образцов с мутациями
				абс.	(%)
katG	315	Ser → Thr	AGC → ACC	198	88,7
		Ser → Asn	AGC → AAC	1	0,45
		Ser → Arg	AGC → ACA	1	0,45
		Ser → Gly	AGC → GGC	1	0,45
	328	Thr → Cys	TGG → TTG	1	0,45
inhA	15	–	C → T	19	8,6
	8		T → G	1	0,45
ahpC	9	–	G → A	1	0,45
Всего				223	100

Тест-система «ТБ-Биочип» позволяет проводить экспресс-диагностику Mycobacterium tuberculosis complex с одновременным определением мутаций в генах rpoB, katG, inhA, и oxyR-ahpC, обусловливающих устойчивость МБТ к рифампицину и изониазиду. Основной причиной устойчивости МБТ к рифампицину является мутация Ser531 ^ Leu. Мутация Ser315 ^ Thr гена katG является одной из основных причин устойчивости к изониазиду у штаммов МБТ, циркулирующих на территории Кыргызской Республики. Множественная лекарственная устойчивость МБТ обусловлена комбинированной мутацией Ser531 ^ Leu (ген rpoB) и Ser315 ^ Thr (ген katG).

• 1.    Ramaswamy S., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis //Tubercle and Lung Disease. – 1998. – Vol. 79, № 1. – P. 3-29.

• 2.    Mikhailovich V., Lapa S., Grydunov D. et al. Identification of Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains by Hybridization, PCR, and Ligase Detection reaction on Oligonucleotide Microchips // J. of Clinical Microbiology. – 2001. – Vol. 39, № 7. – P. 2531-2540.

• 3.    Михайлович В.М., Лапа С.А., Грядунов Д.А., и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ–микрочипе для обнаружения рифампицин резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2001. – № 1. – С. 112-117.

• 4.    Bartfai Z., Soomoskovi A., Kodmon C., et al. Molecular Characterization of Rifampin-Resistant Isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA Sequencing and the Line Probe Assay.// J.Clin. Microbiol. –2001. – Vol. 39, № 10. – P. 3736-3739.

• 5.    Crofton J., Chaulet P., Maher D. Guidelines for the Management of Drug-Resistant Tuberculosis. Jeneva. – 1997. – 55 с.

• 6.    Лабораторная диагностика туберкулеза. // Под ред. Литвинова В.И., Мороза А.М. МНТПЦ борьбы с туберкулезом. – Москва: Медицина и жизнь, – 2006. – 170 с.

• 7.    Kiepiela P., Bishop K., Smith A., et al. Genomic mutations in the katG, inhA, and ahpC genes are useful for the prediction of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from Kwazulu Natal, south Africa. Tuber. Lung Dis. – 2000. – V. 80, № 1. – P. 47-56.

• 8.    Matsiota-Bernard P., Vrioni G., Marinis E. Characterization of rpoB Mutations in Rifampin-resistant Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates from Greece. J.Clin. Microbiol. – 1998. – Vol. 36, № 1. – Р. 20-23.

• 9.    Marttila H. J., Soini H., huovinen P., and Viljanen M.K. katG mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients. // Antimicrob. Agents chemother. – 1996. – Vol. 40, № 10. – Р. 2187-2189.

• 10.    Bakonyte D., Baranauskaite A., Cicenaite J., et al. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical Isolates in Lithuania. Mycobacterium tuberculosis. – 2003. – Vol. 47, № 6. – P. 2009-2011.

• 11.    Воронина Е.Н., Вихрова М.А., Храпов Е.А., и др. Мутация Ser315Thr – основная причина устойчивости к изониазиду у изолятов Mycobacterium tuberculosis, распространенных в Новосибирской и Кемеровской областях. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология – 2004. – № 3. – С. 8-11.

MUTATIONS IN RPOB, KATG, INHA И

AHPC GENES OF RIFAMPICIN- AND ISO

NIAZID- RESISTANT MYCOBACTERIUM

TUBERCULOSIS STRAINS WHICH CIRCU

LATE IN KYRGYZ REPUBLIC

Zh.T. Isakova