Наработка биомассы производственных штаммов бактерий для изготовления лечебно-профилактических препаратов
Рубрика: Ветеринария
Статья в выпуске: 2 т.266, 2026 года.
Бесплатный доступ
В настоящей статье изложены результаты экспериментальных исследований, направленных на получение высокоиммуногенных антигенных компонентов ассоциированной вакцины для специфической профилактики желудочно-кишечных заболеваний телят. С применением широкого спектра элективных питательных сред осуществлена наработка биомассы бактерий Cl. perfringens серотипов А, С, D; E. coli, синтезирующих адгезивные антигены К99, А20; Streptococcus; Salm. enteritidis и Salm. dublin для изготовления ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии, эшерихиоза, сальмонеллеза и стрептококкоза телят. Научно обоснованы и оптимизированы параметры инактивации бактериальных клеток и продуцируемых ими экзотоксинов, используемых для конструирования препарата. Девитализацию культур производственных штаммов проводили с использованием раствора формальдегида в контролируемых термостатных условиях при температурном оптимуме от 37 до 38 °С. Исследования проведены с использованием питательных сред для выращивания микроорганизмов и in vivo на лабораторных животных (белых мышах). Экспериментально доказано, что полная девитализация бактерий Cl. perfringens, Salm. enteritidis и Salm. dublin и их токсинов под сочетанным действием тепла и инактиванта происходит через 240 ч, E. coli – через 120 ч, Streptococcus – через 72 ч. Мониторинг чистоты полученных бактериальных суспензий осуществляли посредством световой микроскопии мазков, окрашенных по Граму, а контроль полноты инактивации – культуральным методом путем высева проб на элективные и дифференциально-диагностические среды: ГРМ-агар, ГРМбульон, кровяной ГРМ-агар, среду Китта-Тароцци, агар Сабуро. Констатировано отсутствие пролиферации микроорганизмов на питательных средах при их инкубации в условиях термостата в течение 10 сут. Это свидетельствует об их абсолютной стерильности и пригодности для последующего конструирования ассоциированного биопрепарата.
Короткий адрес: https://sciup.org/142248500
IDS: 142248500 | УДК: 619:616.98:578 | DOI: 10.31588/2413_4201_1883_2_266_90
Development of biomass of industrial bacterial strains for the production of therapeutic and prophylactic drugs
This article presents the results of experimental studies aimed at producing highly immunogenic antigenic components of an associated vaccine for the specific prevention of gastrointestinal diseases in calves. Using a wide range of elective nutrient media, we produced bacterial biomass of Cl. perfringens serotypes A, C, and D; E. coli, synthesizing adhesion antigens K99 and A20; Streptococcus; Salm. enteritidis and Salm. dublin for the production of an associated vaccine against anaerobic enterotoxemia, escherichiosis, salmonellosis and streptococcosis in calves. The parameters for inactivating bacterial cells and the exotoxins they produce, used to construct the vaccine, were scientifically substantiated and optimized. Devitalization of production strain cultures was carried out using a formaldehyde solution under controlled thermostatic conditions at an optimum temperature of 37 to 38°C. Studies were conducted using nutrient media for growing microorganisms and in vivo on laboratory animals (white mice). It was experimentally proven that complete devitalization of Cl. perfringens, Salm. enteritidis and Salm. dublin bacteria and their toxins are inactivated after 240 hours under the combined action of heat and an inactivating agent, after 120 hours for E. coli and after 72 hours for Streptococcus. The purity of the resulting bacterial suspensions was monitored by light microscopy of Gram-stained smears, and the completeness of nactivation was verified by culture by plating samples on selective and differential diagnostic media: GRM agar, GRM broth, blood GRM-agar, Kitt- Tarozzi medium and Saburo agar. No microbial proliferation was observed on the nutrient media after incubation in a thrmostat for 10 days. This indicates their absolute sterility and suitability for the subsequent construction of an associated bioproduct.
Текст научной статьи Наработка биомассы производственных штаммов бактерий для изготовления лечебно-профилактических препаратов
Цель работы - разработка ассоциированного вакцинного препарата для специфической профилактики желудочно-кишечных инфекций телят, сконструированного на основе наиболее этиологически значимых антигенов возбудителей. Для достижения указанной цели на начальном этапе были сформулированы следующие задачи:
– наработать биомассу бактерий Cl. perfringens, E. coli, Streptococcus; Salm. enter-itidis и Salm. dublin для изготовления лечебнопрофилактических препаратов;
– оптимизировать и валидировать режимы девитализации (инактивации) биомассы производственных штаммов, а также алгоритмы контроля чистоты бактериальных культур и верификации полноты их инактивации.
Условия, материалы и методы. При изготовлении ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии, эшерихиоза, сальмонеллеза и стрептококкоза телят использовали производственные штаммы Cl. perfringens: № 28 (серотип А), № 392 (серотип С), № 213 (серотип Д); два штамма E. coli: «КВ-1» (синтезирующий адгезивный антиген К99) и «ПЗ-3» (синтезирующий адгезивный антиген А20), два штамма сальмонелл, выделенные от больных сальмонеллезом телят: Salm. enteritidis «АБП-17» и Salm, dublin «СН-16», а также патогенный штамм «АА-24»
Streptococcus .
Наращивание биомассы производственных штаммов микроорганизмов осуществляли с применением стандартизированных питательных сред: тиогликолевой среды, ГРМ-агара и ГРМ-бульона, обеспечивающих оптимальные ростовые характеристики патогенов.
Результаты и обсуждение. Культивирование производственных штаммов E. coli, Salmonell. и Streptococcus с целью накопления клеточной массы проводили на плотных питательных средах (ГРМ-агар, кровяной ГРМ-агар). Для наращивания биомассы Cl. perfringens применяли тиогликолевую среду, при этом строгие анаэробные условия культивирования обеспечивали посредством герметизации поверхности среды слоем стерильного медицинского вазелинового масла.
В процессе конструирования ассоциированной вакцины критическим этапом являлась экспериментальная отработка и валидация режимов девитализации клеточной биомассы производственных штаммов и детоксикации продуцируемых ими экзотоксинов.
Инактивация культур производственных штаммов Cl. perfringens осуществляли раствором формальдегида. Результаты исследований по определению оптимального режима инактивации бактериальных клеток Cl. perfringens и их токсинов представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 - Результаты исследований по установлению режима инактивации бактерий Cl. perfringens
|
Концентрация формалина, % |
Срок инактивации, ч |
||||
|
24 |
48 |
72 |
96 |
120 |
|
|
Наличие роста в тиогликолевой среде |
|||||
|
0,3 |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
0,5 |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
0,7 |
+ |
+ |
- |
- |
- |
Примечания: (+) - отмечается рост микроорганизмов, (-) - отсутствует рост микроорганизмов
Исходя из данных таблицы 1, полная потеря жизнеспособности бактерий Cl. perfringens под воздействием формальдегида регистрируется через 96 ч при температурном оптимуме от 37 до 38 °С.
Параллельно проводили in vivo исследования по определению кинетики трансформации экзотоксинов Cl. perfringens в безопасный анатоксин. Биопробы осуществляли на 36 белых мышах, разделенных на 3 группы (по 12 особей). Животные каждой группы были дополнительно разделены на 4 подгруппы (по 3
особи), которым вводили образцы анатоксинов Cl. perfringens , отобранные на различных сроках инактивации. Животным первой группы инъецировали токсин Cl. perfringens штамма 28 после 72, 120, 168 и 240 ч инактивации в дозе 0,5 см³. Аналогичным образом животным 2-й и 3-й групп вводили инактивированные токсины штаммов № 392 и № 213 соответственно. Клиническое наблюдение за лабораторными моделями вели на протяжении 240 ч. Результаты исследований приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты эксперимента по установлению срока перехода токсинов
Cl. perfringens в анатоксин
|
Группа животных |
Токсин штам- |
С |
рок инактивации токсина, ч |
||
|
ма Cl. |
72 |
120 |
168 |
240 |
|
|
perfringens |
Сох |
ранность белых мышей, голов |
|||
|
I |
№ 28 |
0 |
0 |
1 |
3 |
|
II |
№ 392 |
0 |
0 |
2 |
3 |
|
III |
№ 213 |
0 |
0 |
2 |
3 |
Анализ данных, представленных в таблице 2, свидетельствует о 100%-ной выживаемости лабораторных животных в группах, иммунизированных токсином после его 240-часовой экспозиции с инактивантом. Следовательно, полная детоксикация экзотоксина Cl. perfringens и его структурная трансформация в иммуногенный анатоксин под сочетанным воздействием термического фактора и формальдегида достигается при термостатировании в течение 240 ч.
Накопление бактериальной массы производственных штаммов E. coli осуществляли на плотной среде ГРМ-агар в условиях термостатирования при от 37 до 3 °С. По истечении 48 ч инкубирования бактериальный газон E. coli элюировали с поверхности агара изотониче- ским раствором хлорида натрия с последующим внесением формальдегида. В ходе эксперимента тестировались различные концентрационно-временные параметры инактивации. Концентрация формальдегида в суспензии варьировала от 0,3 до 0,7%, а время экспозиции в термостате составляло 24, 48, 72, 96 и 120 ч. Результаты оценки жизнеспособности представлены в таблице 3.
Исходя из результатов, отраженных в таблице 3, абсолютная девитализация клеток E. coli констатируется через 96 ч экспозиции при конечной концентрации формальдегида в диапазоне от 0,3 до 0,7%. В качестве оптимального и технологически обоснованного режима инактивации утверждена экспозиция длительностью 96 ч при концентрации инактиванта 0,5%.
Таблица 3 – Результаты эксперимента по установлению режима инактивации бактерий E. coli
|
Концентрация формалина, % |
Срок инактивации, ч |
||||
|
24 |
48 |
72 |
96 |
120 |
|
|
Наличие роста на ГРМ-агаре |
|||||
|
0,3 |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
0,5 |
+ |
+ |
+ |
– |
– |
|
0,7 |
+ |
+ |
– |
– |
– |
