Нейроиммунный статус реципиентов, подвергшихся в ювенильный период развития многократной трансплантации иммунных клеток с определенными функциональными характеристиками

Основные регуляторные системы организма – иммунная и нервная, обладая общим полем гуморальных факторов и контактируя посредством своих клеточных элементов, характеризующихся выраженным фенотипическим и функциональным сходством, функционируют в тесном взаимодействии и играют важнейшую роль в поддержании гомеостаза на всех этапах онтогенеза; причем характер их взаимодействия определяет особенности психофизиологического статуса индивидуумов и его резервные адаптационные возможности [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]. Ранее нами была продемонстрирована возможность направленного изменения параметров функциональной активности указанных адаптационных систем организма у половозрелых животных трансплантацией иммунных клеток с определенными функциональными характеристиками [10, 11, 12, 13].

Поскольку способность к непосредственному контакту и взаимодействию клеток иммунной и нервной систем приобретается на ранних этапах эмбриогенеза, не исключено влияние транспланта- ции иммунных клеток, проведенной на ранних этапах постнатального онтогенеза, на формирование определенного характера нейроиммунных взаимоотношений реципиентов.

В связи с вышеизложенным целью исследования являлась оценка показателей нейроиммунного статуса половозрелых реципиентов, подвергнутых в ювенильный период развития многократной трансплантации иммунных клеток с определенными функциональными показателями, характерными для животных с оппозитными типами поведения.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на мышах-самцах (CBAxC57Bl/6) F1 (n=280), полученных из лаборатории экспериментальных животных НИИФФМ (Новосибирск). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей в каждой, не менее 2 недель до начала эксперимента на стандартной диете, при свободном доступе к воде и нормальном световом режиме. Содержание экспериментальных животных соответствовало правилам, принятым Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986) и правилами лабораторной практики (приказ № 267 Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003).

Ориентировочно-исследовательское поведение (ОИП) половозрелых 3-месячных животных (интактных и после клеточной трансплантации) оценивали в тесте «открытое поле» [14]. Регистрировалась моторная и исследовательская активность мышей в течение 5 минут с интервалом в 1 минуту. В качестве доноров для клеточной трансплантации использовали мышей с оппозитными (активным и пассивным) типами поведения, иммунные клетки которых характеризуются различной функциональной активностью [15, 16, 17, 18].

Выделение спленоцитов проводилось согласно описанной ранее методике [11, 12]. Далее иммуно-циты доноров с активным (группа 1) либо пассивным (группа 2) типами поведения внутривенно вводили сингенным реципиентам, начиная с 4–5недельного возраста, троекратно в концентрации 5х106 клеток в объеме 0,4 мл среды RPMI-1640 на одно животное с интервалом в 1 неделю. Контрольной группе мышей в аналогичных условиях эксперимента вводилась среда RPMI 1640.

Фенотипирование клеток селезенки мышей-доноров (CBAxC57Bl/6) F1 c активным и пассивным типами поведения и сингенных реципиентов после клеточной трансплантации проводилось методом проточной цитофлуорометрии с помощью аналитической системы FACS Calibur (Becton Discinson, USA) согласно инструкции по эксплуатации, прилагаемой к прибору, с моноклональными антителами против CD3+, СD4+, CD8+, CD19+, CD14+, CD115+ (Ebioscience), помеченными флуорохромами с отличающимися спектрами эмиссии.

Для оценки интенсивности основных звеньев иммунного ответа мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (5% – 0,5 мл).

Гуморальный иммунный ответ оценивали на 5-е сутки после иммунизации по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде. Определение количества антителообразующих клеток в селезенке (АОК) проводилось модифицированным методом A.J. Cunningham [19].

Для определения высоты реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) через 96 часов после иммунизации внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (0,5% – 0,5 мл) вводили разрешающую дозу указанного антигена (50% – 0,05 мл) под апоневроз задней стопы. Формирование реакции ГЗТ оценивали через 24 часа после разрешающей инъекции по степени опухания лапы (изменения её толщины по сравнению с позитивноконтрольной задней лапой того же животного, в которую была введена среда RPMI 1640). Индекс реакции (ИР) выражали в процентах и определяли для каждой мыши по формуле [20]:

ИР=(Ро-Рк)/Рк

Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов, как это было описано ранее [10, 15, 18]. В качестве митогенов использовались субоптимальные концентрации ЛПС E. coli 0111: B4 (Sigma) и конкавалина А (Pharmacia), которые составляли соответственно 20 мкг/мл и 3 мкг/мл.

Статистическая обработка результатов проводилась с применением парного критерия Манна-Уитни (компьютерная программа STATISTICA 10.0 for Windows, StatSoft USA). Данные представлены в виде М±SD либо медианы и интерквартильных размахов (25% и 75% процентилей). Различия считали достоверными при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее нами и другими исследователями было установлено, что ИКК животных с активным и пассивным типами поведения различаются по функциональной активности. В частности показано, что спленоциты мышей (CBAxC57BL/6) F1 с оппозитными типами поведения различны по фенотипическим характеристикам, спонтанной и митоген-индуцированной пролиферативной активности, уровню синтеза и продукции основных регуляторных цитокинов и экспрессии их генов [10, 15, 16, 17, 18, 21].

При анализе поведения половозрелых 12недельных реципиентов, выросших в условиях многократной трансплантации указанных иммунных клеток, проведенной в ювенильный период развития, установлено, что в случае введения клеток от доноров с активным типом поведения в популяции реципиентов регистрируется 7-кратное увеличение процентного содержания особей с активным типом поведения по сравнению с контрольной группой мышей, которым в аналогичных условиях эксперимента вводили среду RPMI 1640 (29,2% и 4,2% соответственно), и 2,5-кратный рост указанного показателя по сравнению с таковым в группе интактных животных соответствующего возраста (29,2% и 11,9% соответственно). При этом регистрируется 5-кратное снижение процентного содержания особей с пассивным типом поведения по сравнению с таковым в обеих контрольных группах (4,2% относительно 22,9% и 19,1% в указанных выше контрольных группах соответственно).

В популяции реципиентов после трансплантации спленоцитов от сингенных доноров с пассивным типом поведения процентное содержание особей с пассивным типом поведения двукратно увеличивалось по сравнению с таковым в контрольной группе мышей, где в аналогичных условиях эксперимента вводилась среда RPMI 1640 (42,5% и 22,9%), и с группой интактных животных соответствующего возраста (42,5% и 19,1 %). При этом регистрировалось двукратное снижение процентного содержания особей с активным типом поведения по сравнению с таковым в группе мышей после аналогичного введения среды RPMI 1640 (4,2% и 2,5% соответственно) и снижение в 4,8 раза по сравнению с группой интактных животных соответствующего возраста (11,9% и 2,5% соответственно) [21]. Результаты свидетельствуют о формировании у подавляющей части животных, выросших в условиях многократной трансплантации ИКК, стереотипа поведения, свойственного животным - донорам клеток.

Поведенческий фенотип половозрелых реципиентов после проведенной в ювенильный период онтогенеза многократной трансплантации спленоцитов от доноров с оппозитными типами ОИП сопряжен с определенной интенсивностью гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа. После

Таблица 1

Интенсивность гуморального и клеточного иммунного ответа у мышей-реципиентов (CBAxC57Bl/6) F1, подвергнутых в ювенильный период онтогенеза трехкратной трансплантации спленоцитов от половозрелых доноров с активным (группа 1) и пассивным (группа 2) типами поведения (M±SD).

Исследуемый показатель	Группа животных
	Контрольная	Группа 1	Группа 2
АОК/10 6	167,7±79,2	121,4±71,9*	67,2±30,7** У
АОК абсол.	36949,7±22675,6	29469,6 ±23636,3	16732,±10619,7** У
ГЗТ(ИР)	27,2±21,02	38,7±10,6**	17,1±3,9** УУ

Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01 по сравнению с соответствующими показателями в группе контроля; У - p<0,05, УУ - p<0,01 между группами животных 1 и 2; n=15 и n=18 в каждой группе животных.

Выявлено также значимое различие в уровнях спонтанной и Кон А-индуцированной пролиферативной активности спленоцитов мышей-реципиентов, которым трансплантировали клетки от доноров с оппозитными типами поведения (табл. 2). При этом у реципиентов после трансплантации спленоцитов от доноров с пассивным типом поведе-

Таблица 2

Пролиферативная активность спленоцитов мышей-реципиентов CBAxC57Bl/6)F1, подвергнутых в ювенильный период онтогенеза трехкратной трансплантации спленоцитов от половозрелых доноров с активным (группа 1) и пассивным (группа 2) типами поведения (M±SD)

Пролиферативная активность (имп/ мин)	Группа животных
	Контрольная (n=36)	Группа 1 (n=45)	Группа 2 (n=45)
Спонтанная	751,8±81,8	1240,3±136,5*	703,9±80,5* УУ
Кон А	15902,5±450,6	14736,2±652,2	12218,6±547,9** У
ЛПС	23122,5±6674,9	24689,9±8667,2	24722,5±8522,2

Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,01 по сравнению с соответствующими показателями в группе контроля; У - p<0,05, УУ -p<0,01 между группами животных 1 и 2.

Фенотипические характеристики ИКК мышей-реципиентов исследуемых групп различны и также сопряжены с функциональной активностью донорских клеток. Так, для группы 1 мышей-реципиентов в половозрелом возрасте было характерно относительно низкое содержание CD4 + -, тенденция к снижению CD8 + - и повышение CD19⁺-лимфоцитов в селезенке относительно контрольной группы животных. Животных группы 2 характеризовало относительно высокое содержание CD3⁺- и CD4⁺-лимфоцитов. При этом для мышей, составляющих группу 2, по сравнению с животными группы 1 характерно относительно низкое содержание CD19 + и более высокое содержание CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, сопряженное, как показано выше, с низким пролиферативным ответом на КонА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, представленные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что после проведенной в ювенильный период онтогене- трансплантации спленоцитов от доноров с активным типом поведения у реципиентов по сравнению с контрольной группой животных регистрируется более низкая интенсивность гуморального и иммунного ответов (относительного числа АОК) и более высокий уровень реакции ГЗТ. Реципиенты после трансплантации спленоцитов от доноров с пассивным типом поведения характеризуются низким уровнем как гуморального, оцененного по числу (относительному и абсолютному) АОК, так и клеточного иммунного ответа, оцененного по высоте реакции ГЗТ (табл. 1).

ния наблюдается также более низкая спонтанная и КонА-индуцированная пролиферативная активность иммунных клеток по сравнению с соответствующими показателями в контрольной группе мышей, что может опосредовать низкий уровень развиваемых клеточных иммунных реакций в этой группе мышей.

за многократной трансплантации иммунных клеток с различными функциональными характеристиками, свойственными животным с оппозитными типами поведения, у реципиентов формируется различный нейроиммунный статус, определяемый перераспределением процентного содержания в популяции половозрелых особей с активным и пассивным типами поведения, сопряженными с определенными количественными и функциональных показателями иммунной системы. При этом особи, выросшие в условиях трансплантации иммуноцитов от доноров с пассивным типом ОИП, характеризуются преимущественно пассивным типом поведения, относительно низким уровнем развиваемых иммунных реакций и пролиферативной активности клеточных элементов иммунной системы. Всё это указывает на снижение адаптационных возможностей организма с повышенным риском развития соматической и психической патологии [1, 2, 8, 21, 22, 23].