Некоторые генотипические характеристики культур Actinobaculum suis, выделяемых от свиней

Все вышеуказанное требует применения современных молекулярно-биологических методов для всестороннего изучения микроорганизмов. В этом плане в последнее время широко применяется идентификация микроорганизмов с помощью изучения нуклеотидного состава их ДНК.

Actinobaculum suis ( A.suis ) – грамположительная, неспорообразующая неподвижная палочка, вызывающая у свиноматок циститы и пиелонефриты (Jones, 1987). Данный возбудитель встречается в свиноводческих хозяйствах во многих странах мира (Wend, 1998). Ранее мы сообщали о первом случае выделения A. suis в Омской области (Плешакова, 1998).

При изучении биологических характеристик изолятов Actinobaculum suis ( Actinomyces suis ), выделенных от свиноматок с клиническими признаками уроциститов и пиелонефритов, нами было установлено, что, наряду со стабильными фенотипическими признаками, некоторые культуры показывают неоднородность биохимических свойств и разную устойчивость к антибиотикам.

Вследствие вышеуказанного целью данного исследования было изучение и сопоставление некоторых генотипических характеристик культур Actinobaculum suis , выделенных от свиней в Омской области и Германии.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили изоляты A. Suis , полученные из содержимого препуциального дивертикула хряков и мочи свиноматок с клиническими признаками уроцистита и пиелонефрита, а также референтный штамм NTCT10373, любезно предоставленный Институтом микробиологии Высшей школы ветеринарной медицины (г. Ганновер, Германия). Кроме того, были исследованы 17 культур A. suis , выделенные в Омской области, и 10 культур возбудителя, изолированных в Северной Германии. Культуры инкубировали на селективном агаре (1) при температуре +37°С, в течение 3 суток в анаэробной системе AnaeroGen Lid., Basingstoke, Hamsphire, England.

Высокомолекулярную ДНК из клеток микроорганизмов выделяли по методу Мармура (2), используя ряд изменений. Бактерии смывали с чашек TNE буфером и осаждали центрифугированием. Биомассу суспензировали в буфере, содержащем 0,02 М трис, 1М сахарозу и 0,1М ЕДТА. Лизис клеток проводили внесением лизоцима фирмы «Signa» с последующей инкубацией в течение 30–60 мин при температуре +37°С. Затем добавляли SDS до 1%. Белок из препарата ДНК удаляли кратковременной (не более часа) обработкой протеиназой К при температуре +37°С. После инкубации добавляли NaCl до концентрации 1М, депротеинизацию ДНК проводили хлороформом и осаждали этанолом. Дальнейшую очистку проводили с помощью РНК-азной обработки и переосаждения изопропиловым спиртом.

Нуклеотидный состав ДНК определяли методом термической денатурации в 0,1 SSC (0,15М NaCl и 0,015М цитрат Na, pH 7,0 со скоростью нагрева 0,5 градуса в минуту. Содержание ГЦ пар рассчитывали по формуле, адаптированной для использования растворов с низкой ионной силой: (Г + Ц) = 2,08 · Т пл – 106,4. В качестве внутреннего стандарта использовали ДНК E. coli с известным нуклеотидным составом.

Метод работипизации («vibotyping»), предложенный Grimontrtol (1986), позволяет определять полиморфизм нуклеотидного состава генов, кодирующих рибосомальную РНК (р РНК). Для риботипизации общая ДНК клетка была получена, как описано у Sambrook et ai. (1989). Расщепление ДНК с энзимом BamHI (NEB, Bad Schwalbach, Germany) проводилось в соответствии с инструкциями производителя. Фрагменты ДНК разделялись в 0,6%-ном агарозном геле при 199 В, в течение 2 ч. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану (блоттинг по Саузерн) и ДНК – ДНК гибридизация проводились, как описано у Sambrooc et al. (1989). В качестве зонда для детектирования генов рРНК плазмида рКК3535, содержащая рРНК-гены E. сoli, была маркирована радиоактивным изотопом фосфора Р по методу Feinberg и Vo-gelstein (1983). Сходство профилей изолятов A. suis определялось по коэффициенту Жаккарда. Дендрограмма была создана с использованием метода UPGMA.

Работа проводилась на базе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ИВМ ОмГАУ, в лаборатории молекулярных исследований ГНКЦ «Вектор» и лаборатории микробиологии Ганноверской высшей ветеринарной школы (Германия).

Результаты исследований

Результаты проведенных исследований показали, что микроорганизмы, изолированные из препуциального дивертикула и мочи свиноматок с клиническими признаками уроцистита и пиелонефрита, имели среднее значение %Г + Ц = 55,6. Пределы варьирования нуклеотидного состава изученных изолятов составляли min 53,6%, max – 56,9% (табл. 1). Анализируя полученные результаты с учетом степени различий ГЦ пар в составе ДНК, исследованные культуры Actinobaculum suis можно разделить на две группы.

Таблица 1 Нуклеотидный состав ДНК изолятов Actinobaculum suis

К первой группе штаммов можно отнести микрооргонизмы % ГЦ, которые меньше 1%, и ко второй – % ГЦ, которых больше данного показателя. Средний арифметический показатель % ГЦ по всем изученным штаммам равнялся 1,4 при min 0,5 и max 2,8. Отмечается, что субстрат, из которого были изолированы исследуемые культуры, будь то содержимое препуциального дивертикула хряков или моча больных свиноматок, не влияет на степень коррелятивных связей с нуклеотидным составом ДНК.

Из литературных данных известно, что принадлежность микрооргонизмов к одному виду определяется положением, когда процентное различие содержания ГЦ пар в ДНК изучаемых штаммов отличается в пределах 5–6%.

Таким образом, нуклеотидный состав ДНК исследованных изолятов Actinobaculum suis в пределах 55,6% ГЦ. Указанное значение % ГЦ, по данным литературы, соответствует показателям нуклеотидного состава микрооргонизмов, относящихся к роду А.suis (55 ± 57 мол % Г + Ц). Низкий процент различия содержания ∆%ГЦ, в сравнении с референтным штаммом, по нашему мнению, указывает на принадлежность выделенных нами микроорганизмов к виду Actinobaculum suis.

При риботипизации 17 омских, 10 немецких изолятов и референтного штамма A.suis NCTC 10373 омечалось 20 различный профилей. При этом все изоляты из Омска проявляли 12 различных профилей, а изоляты из Северной Германии – 7. Некоторые изоляты имели одинаковые профили. Так, среди немецких изолятов отмечалась идентичность между штаммами А1743/90, А2737 и А4046/92, а также между А1536/90 и А4631/92. Из русских 100%-ное сходство профилей проявили изоляты 21МК, 25МК и 27МК,11ПР и 22МК,1А и 3А, а также 3МК и 4МК. Как немецкие, так русские изоляты образовывали кластеры с 75–40% сходства внутри групп. Профили штаммов, выделенных от животных одного хозяйства, проявляли более высокое сходство, чем профили изолятов, выделенных от животных разных хозяйств. Ранее сходство профилей изолятов из одного хозяйства отмечали при изучении других видов бактерий – Listeria monocytogenes (Wiedmann et al. 1997), Yersinia pseudotuberculosis (Lobato et al. 1998), Streptococcus suis (Staays et al. 1998). Исключение в нашем случае составлял изолят 11PR, показавший 100%-ное сходство с изолятом 22МК, а также изолят 2А. В этих случаях высокое сходство может быть объяснено междухозяйственными связями.

Полученные результаты дают основание заключить, что выделенные нами штаммы A.suis не только не отличаются от зарубежных изолятов по своим фенотипическим свойствам, но и проявляют относительно высокую степень родства на генетическом уровне.