Новый эффективный ферментативный способ получения хитоолигосахаридов и оценка их биофункциональных свойств

Funding: state assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation № 075-03-2024-105 (topic № FZMM-2024-0003, registration № NIOKTR 124013000666-5).

Введение. Высшие базидиальные грибы содержат пищевые волокна, включая β-глюканы, хитин и гетерополисахариды (пектиновые вещества, гемицеллюлозы, полиурониды и др.) в количестве 10–50 % от сухой массы. Преимущество нерастворимых пищевых волокон заключается в сокращении времени прохождения пищи через кишечник, предотвращении нарушений регулярности его опорожнения и снижении риска развития колоректального рака [1, 2]. Польза для здоровья растворимых пищевых волокон, и особенно β-(1,3),(1,6)-D-глюканов, заключается в снижении уровня холестерина, концентрации глюкозы в плазме крови, факторов риска развития дегенеративных заболеваний, включая сердечно-сосудистые. Помимо этого, пищевые волокна грибов стимулируют рост полезной микрофлоры кишечника, благодаря чему используются в качестве пребиотиков [3]. Перспективным биологически активным веществом для исследований пищевых волокон, содержащихся в грибах, является хитин, из которого получают различные модифицированные формы, в частности хитозан и хитоолигоса-хариды [4].

Хитозан и хитоолигосахариды (ХОС) относятся к деацетилированным производным хитина. По сравнению с хитином хитозан и ХОС проявляют более высокую биологическую активность, что обусловливает их широкое применение в пищевой промышленности, медицине и сельском хозяйстве [5].

Хитоолигосахариды представляют собой олигомеры N-ацетил-D-глюкозамина (> 85 %) и D-глюкозамина (< 15 %), связанные р-1,4 гликозидными связями. Степень полимеризации (СП) ХОС, которая определяется степенью ферментативного гидролиза хитозана, составляет от 2 до 20, а их средняя молекулярная масса (ММ) -3,9 кДа. ХОС обладают высокой пребиотической активностью - стимулируют рост лакто- и бифидобактерий. Эксперименты на мышах показывают, что ХОС со СП 2–8 обладают свойствами регуляции микрофлоры кишечника. Применение ХОС со СП 2-6 значительно увеличивает моторику кишечника, восстанавливает состав микробиоты кишечника и метаболический дисбаланс. Установлено, что ХОС могут применяться в качестве пребиотиков, поскольку стимулируют рост молочнокислых бактерий, одновременно подавляя кишечные патогены [3]. Согласно исследованиям [5] ХОС (СП 2-8, ММ < 1,5 кДа, СД 99,9 %) стимулируют рост Bifidobacterium и Lactobacillus в концентрациях от 0,1 до 0,5 %. Положительные результаты получены также при использовании ХОС (СП 4-9, Мм < 1,7 кДа, СД 60 %) стимулирующих рост L. paracasei и L. kefir в концентрации 0,1 %.

Кишечник человека населен примерно 100 триллионами микроорганизмов, включая 1000– 1150 видов бактерий [6]. Эти виды взаимодействуют с организмом, регулируя баланс микробиоты кишечника, улучшая функции слизистой оболочки, иммунной системы хозяина, и существенно влияют на здоровье человека [7, 8].

В последние годы исследователи проявляют повышенный интерес к питанию, направленному на модуляцию кишечной микробиоты, в частности с применением хитоолигосахаридов. В совокупности оптимизация технологии получения ХОС и углубленное понимание их биологических функций позволят раскрыть их способность положительно влиять на состояние здоровья человека, что способствует достижению основных целей государственной политики, на- правленной на улучшение качества жизни населения. Таким образом, разработка способов получения хитоолигосахаридов (олигомеров в-1,4-связанного D-глюкозамина) с высокой пребиотической активностью из хитозана ракообразных и хитозан-глюкановых комплексов высших грибов с использованием доступного фермента целлюлазы является актуальной научно-прикладной задачей.

Цель исследования - разработка ферментативного способа получения хитоолигосахари-дов, изучение их физико-химических и пребио-тических свойств.

Задачи: разработать методику получения хитоолигосахаридов (ХОС) путем ферментативного гидролиза как коммерческого хитозана, так и хитозан-глюканового комплекса (ХтзГК), выделенного из плодовых тел грибов Ganoderma lucidum , с использованием доступного ферментного препарата «Целлолюкс-А»; исследовать физико-химические свойства полученных ХОС (характеристическая вязкость, молекулярная масса, степень деацетилирования) и определить их выход из различных исходных материалов; изучить пребиотическую активность полученных ХОС в отношении пробиотических штаммов микроорганизмов ( Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus plantarum , Bifidobacterium bifi-dum ). Оценить эффективность ХОС, полученных из разных источников (хитозана и ХтзГК), в качестве стимуляторов роста пробиотических микроорганизмов; дать оценку целесообразности применения ферментного комплекса целлюлазы и ксиланазы вместо специфических ферментов (хитиназы и хитозаназы) для промышленного получения ХОС с выраженными пребиотическими свойствами.

Объекты и методы. В качестве объектов исследования использовались молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum, выделенные из коммерческих аптечных препаратов «Ацидофилин», «Лактожиналь», «Лактобактерии Рамно-зус-СМ», «Био Лонг Лайф» и «Бифидумбакте-рин»; культивируемые высшие базидиальные грибы Ganoderma lucidum - источник для получения хитозан-глюканового комплекса и хито-олигосахаридов; коммерческий хитозан (изгото- витель: Orison Chemicals Limited, Китай); ферментный препарат «Целлолюкс-А» (ООО ПО «Сиббиофарм», г. Бердск).

Для культивирования молочнокислых бактерий на агаризованных средах использовали селективные питательные среды для роста бактерий рода Lactobacillus , %: глюкоза – 2,0; пептон – 1,0; мясной экстракт – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,4; CH 3 COONa · 3H 2 O – 0,5; полисорбат 80 – 0,1; KH 2 PO 4 – 0,2; (NH 4 )3C6H 5 O 7 – 0,2; % MgSO 4 · 7H 2 O – 0,02; MnSO 4 · 4H 2 O – 0,005; агар микробиологический – 1,0. pH доводили до 6,2 при 25 °C; для Bifidobacterium bifidum , %: панкреатический гидролизат казеина – 3,0; дрожжевой экстракт – 0,5; α -Д-лактоза – 0,25; Д-глюкоза – 0,75; цистеина гидрохлорид – 0,05; NaCl – 0,25; MgSO 4 – 0,05; кислота аскорбиновая – 0,05; CH 3 COONa – 0,03; агар микробиологический – 0,09 (изготовитель – ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Оболенск).

Культивирование молочнокислых бактерий глубинным способом для определения пребио-тической активности ХОС проводили в орбитальном термостатируемом шейкере-инкубаторе (Biosan Orbital Shaker-Incubator ES-20, Латвия) при температуре 37 °C в течение 48 ч. В состав питательной среды (без добавления агара) ХОС из хитин-глюканового комплекса (ХтзГК), ХОС из хитозана, ХтзГК и хитозана добавляли в количестве 0,5 %, ориентируясь на данные, представленные в источнике [9]. Количество посевного материала составляло 10 %. Отбор проб проводили через 6, 12, 24, 48 ч. Культивирование прекращали при значительном уменьшении сахаров питательной среды, пиковом показателе биомассы продуцентов и КОЕ. После ферментации в культуральной жидкости определяли КОЕ в 1 мл среды методом предельных разведений.

Для получения хитозан-глюкановых комплексов (ХтзГК) использовали хитин-глюкановый комплекс, выделенный из плодовых тел грибов Ganoderma lucidum. Получение ХтзГК проводили по следующей оригинальной методике: 1000 г измельченных плодовых тел (размер частиц 100–500 мкм) экстрагировали 70 %-м раствором этанола в течение 48 ч в статических условиях. Остаток в виде биошрота высушивали при температуре 40 °C. Высушенный биошрот вывари- вали с 1 Н NaOH при температуре 85 °C в течение 4 ч. Остаток промывали сначала водопроводной, затем дистиллированной водой для удаления остаточного количества NaOH. Затем к массе остатка добавляли при гидромодуле 1 : 3 3 % раствор H2O2 для депигментации. После чего повторно промывали дистиллированной водой. Остаток высушивали, измельчали и просеивали для получения размера частиц 10–50 мкм.

Дополнительную очистку хитозана и ХтзГК перед ферментативным гидролизом осуществляли следующим образом. Образцы хитозана (20 г) и ХтзГК растворяли в 1 л 1 %-го раствора уксусной кислоты. После фильтрации при пониженном давлении к фильтрату добавляли водный раствор 1 М NaOH для получения осадка. Осадок многократно промывали дистиллированной водой до достижения pH промывной воды около 7. Затем добавляли безводный изопропиловый спирт (200 мл) для удаления небольшого количества пигмента из хитозана и ХтзГК. После этого осадок высушивали в вакуумной печи. Очищенные хитозан и ХтзГК измельчали до порошкообразного состояния (10– 50 мкм).

Ферментативный гидролиз хитозана и ХтзГК для получения хитоолигосахаридов осуществляли следующим образом. Раствор хитозана готовили путем диспергирования 3,00 г хитоза-на/ХтзГК в 20 мл воды, растворения в 12 мл 5 %-й уксусной кислоты и доведения объема до 60 мл водой. Значение pH полученного раствора хитозана/ХтзГК доводили до ≤ 5,60 с помощью NaOH. Добавляли 6 мл 1 %-го раствора ферментного комплекса целлюлазы (6000 ед/мл) и ксиланазы (1700 ед/мл) и инкубировали смесь в течение 24 ч при температуре 50 °C. Реакцию останавливали кипячением в течение 10 мин для денатурации ферментов, которые затем удаляли фильтрацией. Фильтрат концентрировали примерно до 1/20 на роторном испарителе при пониженном давлении. Затем добавляли достаточное количество спирта. Выход полученных образцов определяли гравиметрически.

Определение характеристической вязкости и молекулярной массы осуществляли следующим образом. Для растворения хитозана и ХтзГК в качестве растворителя применяли водный раствор 1 %-й уксусной кислоты, для растворения хитоолигосахаридов – дистиллированную воду.

Молекулярную массу (ММ) полученных образцов рассчитывали по уравнению Марка – Хаувинка – Куна

[η] = KмMα, где [η] - характеристическая вязкость; М - молекулярная масса; Kм и α – эмпирические константы.

Литературные значения констант K и α составляют 1,81 · 10–4 и 0,93 соответственно [10].

Характеристическую вязкость (ХВ) растворов хитозана, ХтзГК и хитоолигосахаридов определяли в модифицированном вискозиметре «Убеллоде» (СКБ «Пущино», Россия) с диаметром капилляра 0,3 мм при 25 °С (точность измерения ± 0,1 с). Значения характеристической вязкости рассчитывали двойной графической экстраполяцией зависимости lnηотн/С от бесконечного разбавления [11].

Степени деацетилирования (СД) определяли методом потенциометрического титрования, описанным в работе [12].

Для статистической обработки данных использованы пакеты анализа Microsoft Excel 2021 (Microsoft, США). Эксперименты проводились в 3 повторностях. Различия между средними значениями считали статистически значимыми при p-value < 0,05.

Результаты и их обсуждение. Известно, что хитиназа, хитозаназа и лизоцим способны гидролизовать частично N-ацетилированные хитозаны, при этом ферментативный гидролиз сопровождается преимущественным образованием димеров, тримеров и тетрамеров N-ацетил-D-глюкозамина. Хитозан также может расщепляться другими неспецифическими ферментами, такими как липаза, папаин, пектиназа и протеаза. Показано, что хитозан может подвергаться биотрансформации до хитоолиго-сахаридов со степенью полимеризации от 3 до 11 за счет воздействия целлюлазы, что является перспективным направлением в первую очередь, с экономической точки зрения. Стоимость целлюлазы значительно ниже стоимости вышеупомянутых ферментов [13].

Схема получения ХОС из хитозана и ХтзГК представлена на рисунке.

Согласно разработанной схеме, для получения ХОС может использоваться как хитозан, полученный из панцирей ракообразных, так и хитозан-глюкановый комплекс из биомассы высших грибов.

Ферментативный гидролиз хитозана и ХтзГК проводился в течение 24 ч при температуре 50 °C, pH 5,0 и использовании 1 %-го раствора ферментного комплекса целлюлазы и ксилана-зы. Установлено, что ферментный комплекс оказывает значительное влияние на деполимеризацию хитозана и ХтзГК.

После 24-часового инкубирования полимеров с целлюлазой и ксиланазой из реакционной смеси отбирали образец, в который при перемешивании добавляли щелочной раствор (1 М NaOH). Отсутствие образования осадка свидетельствовало о деполимеризации хитозана с образованием низкомолекулярных олигомеров. Полученные результаты подтверждаются данными работы [13], в которой в масс-спектрах гидролизатов обнаружены пики, соответствующие массовым числам (M + Na)+ тримера тетрадекасахарида. Продукты реакции представлены преимущественно хитоолигоса-харидами с преобладанием фракций со степенью полимеризации 3–11.

Сравнительный анализ процессов ферментативной деполимеризации хитозана и хитозанглюкановых комплексов позволил оценить влияние природы исходного субстрата на характеристики получаемых хитоолигосахаридов. Физико-химические свойства образцов хитозана, ХтзГК и полученных из них ХОС, представлены в таблице 1. Процесс ферментативного получения ХОС из хитозан-глюкановых комплексов высших грибов характеризуется исключением стадий агрессивной деминерализации и депротеинизации, что отличает его от традиционной технологии переработки панцирей ракообразных. Ферментативная обработка хитозана позволяет получать более чистые хитоолигоса-хариды, тогда как гидролиз хитозан-глюкановых комплексов приводит к образованию смеси хи-тоолигосахаридов и β-глюкоолигосахаридов, обладающей потенциально более высокой биологической активностью.

Схема получения хитоолигосахаридов из хитозана и хитозан-глюканового комплекса Schematic diagram of chito-oligosaccharide production from chitosan and chitosan-glucan complex

Таблица 1

Физико-химические свойства образцов хитозана, ХтзГК и полученных из них ХОС Physicochemical properties of chitosan samples, chitosan-glucan complexes, and chito-oligosaccharides derived from them

Образец	Характеристическая вязкость, дл · г–1	Молекулярная масса, кДа	Степень деацетилирования, %	Выход, % от сухого вещества
ХОС из ХтзГК	3,8±0,2	3,2±0,3	73,6±3,4	78,4±1,3
ХОС из хитозана	4,1±0,3	5,4±0,6	91,5±2,9	94,5±1,6
ХтзГК	20,8±2,1	45,4±2,1	66,7±2,3	10,2±0,8
Хитозан	44,5±1,9	113,6±4,2	88,2±3,1	–

Результаты исследований продемонстрировали, что выход ХОС из хитозана превышал выход ХОС из ХтзГК на 16,1 %. В ходе исследования физико-химических свойств хитозана, хитозан-глюкановых комплексов и хитоолигосаха-ридов установлено, что наибольшими показателями характеристической вязкости (44,5 дл · г–1), молекулярной массы (113,6 кДа) и степени дезацетилирования (88,2 %) обладает коммерческий хитозан. При проведении сравнительной оценки с ХтзГК из биомассы грибов выявлены значительные отличия по этим показателям. У ХтзГК значения ХВ, ММ и СД ниже на 53, 60 и 24 %.

Физико-химические свойства ХОС из хитозана и ХтзГК также отличались. Значения ХОС из хитозана превышали значения ХОС из ХтзГК по ХВ на 7,3 %, ММ на 40,7 и СД на 19,5 %.

Следующим этапом являлось исследование пребиотических свойств полученных ХОС при добавлении их в питательные среды (табл. 2).

Таблица 2

Зависимость концентрации молочнокислых бактерий от содержания в питательной среде источников углеводов при глубинном культивировании

Dependence of lactic acid bacteria concentration on the content of carbohydrate sources in the nutrient medium during submerged cultivation

Источник углевода в питательной среде	Пробиотические штаммы, КОЕ/мл
	L. acidophilus	L. casei	L. rhamnosus	L. plantarum	B. bifidum
Глюкоза	1,44 · 109	1,61 · 109	1,78 · 109	1,36 ·109	2,42 · 109
ХОС из ХтзГК	5,88 · 106	5,94 · 106	2,54 · 106	3,83 · 106	5,38 · 106
ХОС из хитозана	2,38 · 108	2,51 · 108	4,47 · 108	4,57 · 108	7,04 · 108
ХтзГК	8,7 · 105	1,34 · 105	3,23 · 105	5,98 · 105	7,94 · 105
Хитозан	1,28 · 106	1,01 · 106	1,22 · 106	1,03 · 106	2,04 · 106

В результате проведенных исследований установлено, что молочнокислые бактерии показывают максимальный рост на питательной среде, содержащей ХОС из хитозана, достигая наибольших значений от 2,38 до 7,04 · 108 КОЕ/мл. Культивирование штаммов на среде с хитозаном показало более низкие значения КОЕ/мл: от 1,01 до 2,04 · 106.

Необходимо отметить, что хитозан с невысокой молекулярной массой является стимулятором роста молочнокислых бактерий. Однако он может вызывать ингибирование микроорганизмов за счет своей выраженной антибактериальной активности, которая усиливается при достижении высокой молекулярной массы [14].

ХОС имеют меньший размер молекул, чем хитозан, и следовательно, меньшую вязкость и большую растворимость в водных растворах, что усиливает их пребиотические свойства. Пробиотические бактерии ( Lactobacillus, Bifidobacterium ) эффективно гидролизуют β-(1→4)-гликозидные связи ХОС до моносахаридов, которые интегрируются в центральный углеродный метаболизм, обеспечивая энергетические и пластические потребности клетки. Одновременно ХОС функционируют как сигнальные молекулы, индуцирующие экспрессию специфических оперонов утилизации и стимулирующие синтез защитных экзополисахаридов, что повышает резистентность бактерий к стрессовым факторам желудочно-кишечного тракта. Ключевым элементом селективности является способность пробиотических микроорганизмов ферментировать ХОС с активной продукцией короткоцепочечных жирных кислот, что приводит к локальному снижению pH и редокс-потенциала среды, создавая условия, благоприятные для развития полезной микрофлоры и подавляющие рост патогенных конкурентов.

Полученные экспериментальные данные с использованием в качестве компонентов питательной среды хитозана и полученных из него ХОС незначительно отличались от результатов культивирования на питательной среде с глюкозой. В то же время рост на питательных средах с ХтзГК и ХОС из ХтзГК показал более низкие значения от 1,34 до 8,7 · 105 и от 2,54 до 5,94 · 106 КОЕ/мл. Это обусловлено тем, что в структуре хитозанглюканового комплекса присутствуют α- и β-глюканы, которые могут ингибировать рост бактерий [15]. Установлено, что ХОС с более высокой молекулярной массой также ингибируют рост многих молочнокислых бактерий [16].

Морфологические характеристики клеток пробиотических штаммов бактерий при культивировании на исследуемых питательных средах различного состава существенно не отличались.

Таким образом, проведенные исследования показывают перспективность использования ферментного препарата «Целлолюкс-А» при получении ХОС, обладающих пребиотическими свойствами, как из хитозана ракообразных, так и из хитозан-глюкановых комплексов высших грибов.

Заключение

• 1.    Впервые доказана высокая эффективность применения доступного ферментного препарата «Целлолюкс-А» (целлюлаза – 6000 ед/мл, ксиланаза – 1700 ед/мл) для получения хитоолигосахаридов из различных источников. Показано, что этот подход является экономически выгодной альтернативой использованию специфических, дорогостоящих ферментов (хитиназы и хитозаназы), недоступных для промышленного получения ХОС. Экономическая эффективность метода обусловлена низкой

• 2.    Комплексно изучены физико-химические свойства образцов хитозана из ракообразных, хитозан-глюкановых комплексов из биомассы высших грибов и полученных из них хитоолиго-сахаридов. Установлено, что ХОС, полученные из хитозана, характеризуются более высокими показателями характеристической вязкости (4,1 дл · г ⁻ ¹), молекулярной массы (5,4 кДа) и степени деацетилирования (91,5 %), что превышает соответствующие значения для ХОС из хитозан-глюканового комплекса грибов Ganoderma lucidum на 7,9 %, 68,8 и 24,3 % соответственно. Выявлены корреляционные зависимости между этими показателями и пребио-тической активностью: оптимальный баланс молекулярной массы (3–6 кДа) и высокая степень деацетилирования (> 90 %) обеспечивают максимальную биодоступность и усвояемость олигосахаридов пробиотическими микроорганизмами. При этом выход ХОС из хитозана (94,5 %) значительно превышает выход из ХтзГК (78,4 %), что дополнительно подтверждает технологическую эффективность данного подхода.

• 3.    Впервые проведена комплексная оценка пребиотической активности хитозана, хитозанглюкановых комплексов и хитоолигосахаридов в отношении пяти ключевых для пищевой промышленности пробиотических штаммов. Установлено, что ХОС из хитозана проявляют выраженную стимулирующую активность в отношении всех тестированных штаммов, особенно Bifidobacterium

• 4.    На основании проведенных исследований разработаны научно обоснованные рекомендации по выбору оптимального сырья и условий получения ХОС с пребиотическими свойствами. Результаты исследования соответствуют приоритетным направлениям развития биотехнологии в Российской Федерации и могут быть использованы для создания отечественных пре-биотических препаратов, способствующих решению задач импортозамещения в пищевой и сельскохозяйственной отраслях. Перспективы дальнейших исследований включают изучение in vivo эффектов полученных ХОС, оптимизацию технологических параметров для промышленного производства, а также разработку функциональных пищевых продуктов с использованием синтезированных хитоолигосахари-дов. Особый интерес представляет исследование синергетического действия ХОС из хитозана и β-глюканов из грибов, которое может расширить спектр их биологической активности и повысить эффективность применения в профилактике метаболических нарушений и заболеваний желудочно-кишечного тракта.

стоимостью препарата «Целлолюкс-А» (широко используется в сельском хозяйстве и пищевой промышленности), упрощением и ускорением технологического процесса за счет использования мягких и легко контролируемых условий неспецифического ферментативного гидролиза (температура – 50 °C, pH – 5,0, время – 24 ч) и возможностью применения стандартного производственного оборудования. Полученные результаты открывают перспективу для масштабирования технологии получения ХОС с заданными функциональными свойствами.

bifidum . При добавлении ХОС в питательную среду количество колониеобразующих единиц на мл составило для L. acidophilus – 2,38 · 10⁸; L. casei – 2,51 · 10⁸; L. rhamnosus – 4,47 · 10⁸; L. plantarum – 4,57 · 10⁸; B . bifidum – 7,04 · 10⁸. ХОС из ХтзГК показали более низкую пребиотическую активность (2,54–5,88 · 10⁶ КОЕ/мл) в сравнении с ХОС из хитозана. Выявлены значительные различия в эффективности ХОС в зависимости от источника их получения: активность ХОС из хитозана превышает активность ХОС из ХтзГК в 37–85 раз, что связано с присутствием в хитозан-глюкановом комплексе грибов α- и β-глюканов, снижающих биодоступность полученных олигомеров. Полученные данные позволяют рекомендовать ХОС с молекулярной массой 5–6 кДа и степенью деацетилирования > 90 % в качестве эффективных пребиотических добавок для функциональных пищевых продуктов.