Новый метод люминесцентного анализа клеток железистого желудка цыплят с использованием флуорохрома «Steins all»

В настоящее время в биологии и медицине все чаще применяется люминесцентный спектральный анализ, обеспечивающий изучение внутриклеточных химических процессов с сохранением всех морфологических структур клеток и тканей. При использовании метахроматического люминесцентного красителя, возникает возможность одновременного выявления различных органических соединений [2-4]. Таким свойством обладает люминесцентный краситель «Steins all», вызывающий достаточно яркую метахроматическую люминесценцию с формированием двух полос в спектре люминесценции, характерных для нуклеиновых кислот (НК) и белков [1]. Поскольку функциональное состояние клеток в значительной степени определяется степенью выраженности нарушений обмена этих органических соединений, целью данной работы стала разработка метода люминесцентного спектрального анализа с использованием флуорохрома «Steins all». Учитывая, что первой мишенью на пути проникновения возбудителей сальмонеллеза в организм птиц является железистый желудок, в качестве объекта исследования были выбраны клетки его слизистой оболочки.

Материал и методы. Для проведения исследования использовали 350 цыплят породы Хайсекс коричневый, которые были разделены на 2 группы: контрольную (200 цыплят) и опытную (150 цыплят). Для экспериментального заражения использовали двухдневных цыплят, взятых из благополучного по сальмонеллезу хозяйства, которых инфицировали перорально бактериями Sаlmonella еnteritidis в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/голову. Цыплятам контрольной группы вводили физиологический раствор в объеме 0,2 мл/голову. Изучали гистологические препараты железистого желудка цыплят обеих групп на 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 15, 21, и 30 сутки их жизни. Гистологические срезы толщиной 4-7 мкм изготавливали на микротоме «Mikrom HM450» (Германия) из парафиновых блоков кусочков железистого желудка, фиксированных в 10 % нейтральном забуференном водном растворе формалина.

Люминесцентномикроскопические характеристики определяли на гистопрепаратах, окрашенных 10“ ⁴ М спиртовым раствором «Steins all» по методике, разработанной применительно к гистологическим срезам. Спектры люминесценции эпителия альвеолярных желез получали с помощью универсального цветоанализатора микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К (рис. 1).

Рис. 1. Спектры люминесценции эпителия альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят контрольной (1) и опытной (2) групп. Гистологические срезы. Окраска «Steins all». По оси ординат – интенсивность люминесценции ( I ), по оси абсцисс – длина волны ( λ, нм )

Из рис. 1 видно, что в спектре люминесценции эпителия имеется две полосы максимума излучения: при длине волны 484 нм, характерной для НК, и 620 нм – для белков. Данные длины волн принимались во внимание при установлении коэффициента соотношения НК и белков в эпителии альвеолярных желез. Поскольку величина интенсивности люминесценции в процессе проведения исследования колебалась в очень больших пределах, для получения сопоставимых результатов был применен эталон, что позволило рассчитывать количество органических веществ в условных единицах. В качестве эталона ( I Э ) была использована максимальная величина интенсивности люминесценции промышленно изготовленного уранового стекла ЖС-19 толщиной 1,5 мм при длине волны 540 нм. Исходя из этого, количество НК в эпителии альвеолярных желез определяли по формуле:

= In , где

I э

X – количество НК в условных единицах;

I n – величина интенсивности люминесценции при длине волны 484 нм.

Количество белков в эпителии альвеолярных желез рассчитывали по формуле:

Y = ^{I b} , где

э

Y – количество белков в условных единицах;

I b – величина интенсивности люминесценции при длине волны 620

нм.

Для исключения влияния аутолиза, обусловливающего снижение показателей количественного содержания органических веществ в тканях, проводили фотометрирование трех участков с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, выявляемой при визуальной микроскопии. При определении коэффициента соотношения НК и белков (К) учитывали максимальное значение из трех полученных результатов, и определяли его по формуле:

К=

X

max

Y max

, где

X max – наибольшее количество НК в условных единицах;

Y max – наибольшее количество белков в условных единицах.

Коэффициенты соотношения органических веществ (НК и белков) определяли у цыплят контрольной и опытной групп.

Результаты исследований и обсуждений результатов. В окрашенных «Steins all» гистологических срезах стенки железистого желудка наблюдали своеобразную люминесцентномикроскопическую картину, характеризующуюся сочетанием синего, зеленоватого и малиново-красного цветов с разной степенью интенсивности на различных участках серозной, слизистой оболочек и мышечного слоя железистого желудка. Обнаруживаемая визуально люминесценция отражала особенности распределения в его стенке НК и белков, связанных с используемым флуорохромом.

Методом микроспектрального анализа были получены коэффициенты соотношения НК и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Динамика изменения коэффициентов соотношений у цыплят контрольной группы укладывалась в картину умеренного постепенного увеличения их значений с 1 по 30 сутки (рис. 2, 1).

Данное обстоятельство может быть объяснено постепенным и опережающим увеличением интенсивности люминесценции при длине волны 484 нм ( I n ) относительно возрастания ее величины при 620 нм ( I b ), которое наблюдалось в спектрах люминесценции клеток данной зоны. Эта тенденция сохранялась на протяжении всего периода увеличения возраста

Рис. 2. Изменение показателей коэффициентов соотношений НК и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят контрольной (1) и опытной (2) групп. По оси ординат – значения коэффициентов соотношений НК и белков ( К ), по оси абсцисс – сутки жизни (сут).

Рис. 3. Величина интенсивности люминесценции НК ( In ) белков ( Ib ) в спектре люминесценции эпителия альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят контрольной (1) и опытной (2) групп. По оси ординат – величина интенсивности люминесценции, по оси абсцисс – сутки жизни

У цыплят, инфицированных Sаlmonella еnteritidis, на кривой коэффициентов соотношения НК и белков, на 3 сутки жизни (1 сутки с момента заражения) отмечалось резкое увеличение данного коэффициента, что могло быть следствием роста I n на фоне снижения I b (рис. 3, 2). В последующие сутки значение коэффициентов соотношения органических веществ уменьшалось, что могло быть результатом более быстрого роста I b по сравнению с увеличением I n , причем, начиная с 7 суток, значение коэффициентов было значительно меньше аналогичных цифр контрольной группы.

Заключение. Проведенное исследование показало, что разработанный метод люминесцентного спектрального анализа с использованием метахроматического люминесцентного красителя «Steins all» (в собственной модификации) позволяет определять коэффициенты соотношений НК и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Динамика изменений коэффициентов соотношения органических соединений отражает особенности развития нарушений внутриклеточного обмена этих веществ на протяжении всего патологического процесса – экспериментального сальмонеллеза. Результаты, полученные с помощью разработанного метода микроспектрального анализа, свидетельствуют о возможности выявления уже на ранних стадиях заболевания сальмонеллезом (до развития характерной патоморфологической и клинической картины) глубоких метаболических изменений в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Данный метод может быть полезным при формировании принципиально нового подхода к вопросу создания современных методов диагностики, профилактики и лечения сальмонеллеза.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Карнаухов, В.Н. Люминесцентный анализ клеток [Электронный ресурс]: учебное пособие – Пущино. Электронное из-во «Аналитическая микроскопия». – 2002. – Режим доступа: http:cam.psn. ru: Р.В. Гуркин, свободный. – Загл. с экрана. – № гос. регистрации 6072 от 4 февраля 2002 г. 2. Пирс, Э. Специальные методы выявления веществ, содержащих углеводы. Метахромазия // Гистохимия. Теоретическая и прикладная. Пер. с англ. – Изд-во иностран. лит., 1962. – С. 224-236. 3. Dahlberg, A.E. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agaroseacrylamide composite gels / Dahlberg, A.E.., Dingenon C.W., Peacock A.C. // J. Mol. Biol. – 1969. – V. 41. – P. 139-147. 4. Haag, D. Simultaneous differential staining of nucleic acids and proteins in histological tissues by means ofj-band effect / D. Haag, C. Tschahargane, K. Goerttler // Histochemie. – 1971. – V. 26. – P. 190-193.

НОВЫЙ МЕТОД ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА КЛЕТОК ЖЕЛЕЗИСТОГО ЖЕЛУДКА ЦЫПЛЯТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРОХРОМА «Steins all»

Акчурин С.В., Ларионов С.В.

Резюме

Метод люминесцентного спектрального анализа с использованием метахроматического флуоресцентного красителя «Steins all» (в модификации автора) позволяет изучать динамику изменений коэффициентов соотношения нуклеиновых кислот и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Полученные авторами результаты свидетельствуют о возможности использования данного метода для выявления ранних метаболических изменений до возникновения характерной патоморфологической и клинической картины сальмонеллеза цыплят.

MODERN METHOD OF LUMINESCENT ANALYSIS OF GLANDULAR STOMACH PART CELLS IN CHICKENS USING FLUORCHROME «Steins all»

Akchurin S.V., Larionov S.V.