Новый пищевой пептид для предупреждения фотостарения клеток: характеристика и подтверждение эффективности invitro

Длительное действие ультрафиолетового облучения (УФО) на кожу может вызывать эффект фотостарения, покраснения и на уровнях клетки способствует образованию активных форм кислорода (АФК) [1]. При этом вся теория старения клеток основывается на теории образования свободных радикалов за счет накопления АФК в митохондриях клеток, следовательно, клетка является мишенью негативного действия УФО в целом на организм [2, 3]. Накопление АФК приводит к повреждению ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты (АОЗ) кожи, окислительному повреждению геномной и митохондриальной ДНК [4]. Рассматривая теорию старения митохондрий клеток, следует отметить связь между синтезом АТФ и переносом свободных электронов. Так, функционирование митохондриальной цепи переноса электронов регулирует выработку АТФ в клетках и активизирует ряд ферментных комплексов с условными номерами 1–5. Так, кофермент Q10 регулирует активность комплексов 2 и 5 и перенос электронов в митохондриях в целом.

На фотостарение и выживаемость клеток под действием УФО оказывает влияние белок SIRT-1, а ослабление его активности - один из критериев оценки начала старения [5].

SIRT-1 относится к семейству сиртунинов, катализирующих деацетилирование различных субстратов путем использования никотинамида [6], усиливает пролиферацию pGC-1α и p53 в некоторых сигнальных путях, включая PI3K-Akt, Rap1/Ras и путь, регулирующий продолжительность жизни клеток [7]. SIRT1 способен регулировать гомеостаз клетки, повышать выживаемость нейронов и митохондриальный биогенез [8, 9].

УФО вызывает экспрессию гена циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), регулирующего воспалительные процессы в коже и снижающего активность SIRT-1 [10]. В исследованиях [11] установлено, что белок SIRT-1 защищает клетки от окислительного стресса и препятствует образованию АФК в нейронах, клетках эндотелия и миокарда крыс сердечной мышцы, нейронах и активируется для защиты клеток от окислительного стресса. Повышение активности SIRT-1 и PGC-1α ограничивает выработку АТФ, что снижает окислительный стресс. В исследованиях [12] установлено, что активация PGC-1α ограничивает синтез энергии в митохондриях и ослабляет окислительный стресс и, соответственно, предупреждает фотостарение.

Вышеуказанные белки и пептиды также использовались для лечения пигментации, улучшения синтеза внеклеточного матрикса, модуляции врожденного иммунитета и воспаления. Использование пептидов имеет ряд преимуществ, таких как их селективность, отсутствие нормативных требований к их применению на рынке и отсутствие у них иммуногенности. Напротив, низкая липофильность и высокая молекулярная масса пептидов могут негативно влиять на их всасывание в коже. Результаты исследования эффективности пептидов для дерматологического применения показаны в работе [13].

Пептиды обладают способностью модулировать несколько иммунных механизмов, связанных с воспалением и заживлением ран в организме хозяина. Исследования применимо- сти пептидов на коже, а также их безопасность при местном применении представлены в работе [14]. Биологически активные пептиды можно получить путем гидролиза соевого белка пепсином и трипсином [15] и яичного белка [16].

Фракция пептида (CDP), полученная из хлореллы, продемонстрировала способность снижать экспрессию генов нескольких белков в фибробластах, облученных ультрафиолетовым излучением, таких как MMP-1 и богатый цистеином 61 (CYR61), а также белка-хемоаттрактанта моноцитов-1 (MCP-1). Активация MMPs связана с фотостарением, ускоряющим разрушение коллагена кожи и ингибирующим синтез коллагена ECM. Ингибирование экспрессии ММП или активация синтеза коллагена могут быть стратегией предотвращения образования морщин, связанных с фотостарением [17]. Аналогичным образом обогащенные пептидами экстракты из микроводоросли Arthrospira platensis эффективно способствуют увлажнению кожи, повышая экспрессию генов нескольких факторов, специфически участвующих в поддержании водного баланса в кератиноцитах (аквапорин 3, синтаза 3 гиалуроновой кислоты и филагрина). Кроме того, авторами работы [18] было обнаружено, что ингибирование выработки АФК было вызвано агентами окислительного стресса.

Необходимо учитывать некоторые ограничения природных пептидов, такие как взаимодействие с другими неспецифическими биологическими компонентами и риск потенциальных аллергенов. С другой стороны, выделение и определение характеристик одной пептидной фракции может быть очень сложной задачей из-за высоких затрат. Поэтому работа с синтетическими пептидами иногда становится более привлекательной.

Поэтому целью работы является конструирование, синтез, характеристика пептида и оценка его влияния на процесс фотостарения в эксперименте in vitro.

Материал и методы исследования

В качестве объекта исследований использован сконструированный пептид со следующей последовательностью аминокислот CTKSICTKKTLRTCPPIC. Синтез пептида осуществляли в компании Pepmic Co., Ltd (Сучжоу, Китай) методом трехфазного синтеза. Прогностическую модель пептида строили по программе определения токсичности , что представляет собой надежный способ определения приоритетности молекул с небольшой цитотоксичностью или без нее для последующей разработки.

Антигенность (аллергенность) пептида оценивали по программе Эта программа прогнозирует те сегменты последовательности белка, которые, вероятно, будут антигенными, вызывая реакцию антител. Заявленная точность метода составляет около 75 %.

Идентификацию пептида проводили на платформе PeptideAtlas, которая характеризуется как общедоступный сборник пептидов, идентифицированных в ходе большого набора тандемных экспериментов по протеомике с масс-спектрометрией. Выходные файлы масс-спектрометра собираются для человека, мыши, дрожжей и ряда других организмов и выполняются с использованием новейших поисковых систем и последовательностей белков. Все результаты поиска последовательностей и спектральной библиотеки впоследствии обрабатываются для единообразного определения вероятности правильной идентификации для всех результатов и для обеспечения высокого качества базы данных наряду с частотой ложных обнаружений и на уровне всего atlas ; на платформе UniProt, которая является ведущим в мире высококачественным, всеобъемлющим и свободным доступным ресурсом по последовательности белков и функциональной информации [19] в национальном центре биотехнологической информации NCBI .

Физические и химические характеристики пептида оценивали с помощью платформы ProtParam . Вычисленные параметры включали молекуляр- ную массу, теоретический pI, аминокислотный состав, атомный состав, коэффициент экстинкции, расчетный период полураспада, индекс нестабильности, алифатический индекс и общее среднее значение гидропатичности.

Прогнозирование характеристик пептида также осуществляли по базе данных пептидов APD . Конструирование пептида проводили с использованием платформы Enalos InSilicoNano – онлайн-инструмент поддержки принятия решений для проектирования и виртуального скрининга наночастиц in silico /).

Для определения фотостарения использовали фибробласты легкого человека (Fibr), которые культивировали в среде DMEM при температуре 37 ° С в атмосфере с 5 % содержанием СО 2 в СО 2 -инкубаторе Galaxy CO170R. Фотостарение клеток оценивали по их жизнеспособности. Определение жизнеспособности клеток приводили с помощью МТТ-теста.

Для эксперимента Fibr рассаживали в 96-луночные планшеты в количестве 0,5×10⁶ клеток на лунку в 100 мкл среды, инкубировали в течение 24 ч, затем подвергали воздействию ультрафиолетового излучения с мощностью светового потока 35 Дж/см² в течение 45 мин. Затем клетки инкубировали в течение 24 ч, добавляли 10 мкл раствора 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) с конечной концентрацией 0,5 мг/мл и инкубировали в CO 2 -инкубаторе Galaxy CO170R (New Brunswick, Канада) в течение 4 ч (контроль).

Клетки рассаживали в 96-луночные планшеты в количестве 0,5×106 клеток на лунку в 100 мкл среды, добавляли 50 мкг/мл исследуемого пептида и инкубировали в течение 24 ч, затем подвергали воздействию ультрафиолетового излучения с мощностью светового потока 35 Дж/см2 в течение 45 мин. Затем клетки инкубировали в течение 24 ч, добавляли MTT и инкубировали в течение 4 ч (опыт). Интенсивность окраски измеряли с помощью микроплан-шетного спектрофотометра по методике [20].

Результаты исследований и их обсуждение

Было проведено конструирование пептида на платформе Enalos InSilicoNano, использующей базу данных PubChem в рамках виртуального синтеза пептидов и скрининга. Был получен пептид с молекулярной формулой C 83 H 150 N 24 O 24 S 4 со следующей аминокислотной последовательностью: CTKSICTKKTLRTCPPIC .

С помощью платформы ProtParam были получены его физико-химические характеристики. Количество аминокислотных остатков в пептиде – 18. Атомный состав пептида был следующим: углерод (C) – 83, водород (H) – 150, азот (N) – 24, кислород (O) – 24 и сера (S) – 4. Формула: C 83 H 150 N 24 O 24 S 4 . Общее количество атомов: 285. Общее количество положительно заряженных остатков равнялось 4, молекулярная масса составила 1996,49 Да, теоретическая изоэлектрическая точка (pI) была на уровне 9,25. Общее гидрофобное соотношение, определенное APD было равно 39 %, гидрофобность пептида по Уимли - Уайту в целом остатке – 3,23. Потенциал связывания с белками (индекс Бомана) составил: 1,4 ккал / моль. Поскольку последовательность содержала четное количество Cys, она могла образовывать (1) связанную дульсульфидными связями дефензиноподобную бета-структуру (~ 16–60 остатков АА).; (2) спиральные структуры, содержащие S-S связь; или (3) множественные тиоэфирные связи, как в антибиотиках, так как содержание Thr / Ser было высокое.

Внешний коэффициент экстинкции был равен 250 М-1 см-1 при длине волны 280 нм в водном растворителе. Абсолютный был на уровне 0,125 М-1 см-1, при условии, что все пары остатков Cys образовывали цистины.

Предполагаемый период полувыведения in vivo составлял более 10 ч. Период полураспада – это прогноз времени, необходимого для исчезновения половины количества белка в клетке после его синтеза. ProtParam полагается на «правило N-конца», которое связывает период полураспада белка с идентичностью его N-концевого остатка; прогноз был дан для 3 модельных организмов (человека, дрожжей и кишечной палочки). Правило N-конца основано на наблюдениях о том, что идентичность N-концевого остатка белка играет важную роль в определении его стабильности in vivo. Правило было установлено в результате экспериментов, в ходе которых изучалась метаболическая судьба искусственных белков бета-галактозидазы с различными N-концевыми аминокислотами, сконструированных методом сайт-направлен-ного мутагенеза. Сконструированные таким образом белки beta-gal имели разительно отличающийся период полураспада in vivo (от более чем 100 ч до менее чем 2 мин) в зависимости от природы аминокислоты на аминоконце и от экспериментальной модели.

Индекс нестабильности позволяет оценить стабильность пептида в пробирке. Пептид, индекс нестабильности которого меньше 40, считается стабильным, значение выше 40 указывает на то, что белок может быть нестабильным. Индекс нестабильности исследуемого пептида составлял 37,77, что позволяет его классифицировать как стабильный.

Алифатический индекс белка определяется как относительный объем, занимаемый алифатическими боковыми цепями (аланином, валином, изолейцином и лейцином). Его можно рассматривать как положительный фактор, повышающий термостабильность пептида. Алифатический индекс исследуемого пептида составлял 65,00, что свидетельствует о его термостабильности, что позволяет вводить в качестве функционального ингредиента в пищевые продукты, подвергающиеся термической обработки в процессе производства.

Индекс гидропатичности – это число, отражающее гидрофобные или гидрофильные свойства боковой цепи аминокислоты. Среднее значение гидропатичности у исследуемого пептида составляло 0,011, что является оптимальным для обеспечения биодоступности пептида.

На основании полученных характеристик пептида можно предположить, что его можно использовать в качестве действующего начала в биологически активных добавках и пищевых продуктах с заданными свойствами.

При создании нового биологически активного вещества (БАВ) необходимо учитывать его антигенность/аллергенность.

Для прогнозирования антигенных детерминант известно несколько методов, основанных на различных физико-химических свойствах экспериментально определенных эпитопов (гидрофильность, биодоступность), из которых антигенный индекс и Preditop являются важными показателями. Самым простым и доступным методом прогнозирования антигенных детерминант является метод, основанный на наличии аминокислотных остатков в экспериментально определенных эпитопах. Прогнозирование антигенных детерминант с помощью этого метода проводили на сайте Результаты исследований представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 – Прогнозирование антигенных детерминант пептида CTKSICTKKTLRTCPPIC

Полученный пептид не являлся антигенным, так как среднее значение было равно 1,0912 (более 1,3 – пептид потенциально является антигенным). В исследуемом пептиде не было антигенных детерминант, что позволило использовать его в составе пищевой продукции, не предупреждая потребителя о возможных аллергенных реакциях при его употреблении.

Проведено исследование по определению токсичности пептида (рис. 2).

I оксинопред

Разработка и прогнозирование токсичных пептидов

Гласная        Дизайнерский Пептид        Пакетная отправка        Сканировататс бс/жа        Скагатроошатс мопва        Список Мот»®оо        OMSCal        Матрицы        Алгоритм

Спрайма

Генерация аналогов пептидов и прогнозирование их токсичности

Оригинальный Пептид

Пептидная пос лед ом те понос тт>   | Положение му s               •                 s                   s - .■ - . - меха • Боковой Каркас •               s                     $ идрофильиость

CTKSICTKKTLRTCPPIC          Никакой мутации          126 Нетоксичен          -0 22                0 58                0 58            -0 01             0 75                0 07

Рисунок 2 – Прогнозирование токсичности пептида CTKSICTKKTLRTCPPIC

На основании аминокислотной последовательности, гидрофобности, гидропатии, гидрофильности и других характеристик пептида CTKSICTKKTLRTCPPIC по программе Токси-нопред было установлено, что исследуемый пептид не являлся токсичным.

Идентификация пептида была проведена на платформах PeptideAtlas, UniProt и в базе национального центра биотехнологической информации NCBI. Результаты представлены на рисунках 3–5.

UniProt ^ BLAST Align Поиск пептидов Сопоставление идентификаторов SPARQL UriiProtKB

Дополнительно I Список

Поиск

Результаты работы инструмента

Ниже приведены результаты анализа вашего инструмента за последние О 7 дней. Если у вас запущены задания Tools, вы можете перейти на другие страницы, и по завершении задания вы получите уведомление.

Тип

.Статус,,

ПОИСК CTKSICTKKTLRTCPPIC

ПЕПТИДОВ

2024-09-28 Создано О

(Й о

РМ2О24О92833асИс4 5ас1в48а98с9Не7601М427()

ПОИСК

CTKSICTKKTLRTCPPIC

ПЕПТИДОВ

2024-09-28 завершено (результаты не найдены)

21-19

(Й О

Рисунок 3 – Результаты идентификации пептида CTKSICTKKTLRTCPPIC на платформе UniProt

Рисунок 4 – Результаты идентификации пептида CTKSICTKKTLRTCPPIC на платформе PeptideAtlas

National Library of Medicine

National Center for Biotechnology Information

Л В Protein не был найден следующий термин: CTKSICTKKTLRTCPPIC

Базы данных

Рисунок 5 – Результаты идентификации пептида CTKSICTKKTLRTCPPIC на платформе в базе национального центра биотехнологической информации NCBI

Из данных, представленных на рисунках 3–5, видно, что пептид CTKSICTKKTLRTCPPIC являлся уникальным.

В результате проведенных исследований по влиянию пептида на фотостарение клеток, обработанных ультрафиолетовым излучением, было показано, что обработка клеток фибробластов легкого человека (Fibr) ультрафиолетовым излучением достоверно (p≤0,01) снизила жизнеспособность 47 % клеток, культивирование клеток с пептидом значительно уменьшило отрицательное воздействие ультрафиолетового излучения. Так, жизнеспособность фибробластов при культивировании с пептидом и облученных ультрафиолетовыми лучами составила 92 %. Соответственно, использование пептида снижает эффект фотостарения клеток в 1,9 раза.

Заключение

Сконструирован новый пептид, дана характеристика его физико-химических свойств. Установлено, что пептид уникален, не токсичен и не антигенен. В эксперименте in vitro показано, что полученный пептид предупреждает фотостарение клеток.