О дозазависимом влиянии экзогенного 20-гидроксиэкдизона на глоточную железу и поведение взрослых пчел Apis mellifera L.
Автор: Авдеев Н.В.
Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology
Рубрика: Физиология адаптаций
Статья в выпуске: 6 т.59, 2024 года.
Бесплатный доступ
20-Гидроксиэкдизон (20Е) - биологически активное вещество, оказывающее множественной действие как на позвоночных, так и на беспозвоночных. У членистоногих стероидный гормон 20Е в первую очередь известен как гормон линьки доимагинальных стадий, относительно недавние исследования свидетельствуют об активности 20Е у взрослых насекомых. Однако результаты исследований его эффектов противоречивы, а попытка коммерческого использования препаратов 20Е в пчеловодстве не имела успеха, вероятно, из-за толерантности Apis mellifera L. к экзогенному 20Е вследствие усиления его метаболизма или активации гематоэнцефалического барьера. В настоящей работе в модельном опыте мы показали, что биологическое действие 20Е на молодых пчел проявляется в дозозависимом влиянии на запасание корма в ячейках сот, на развитие глоточной железы и накопление в меде секретируемого ею пролина. Целью исследования было выявление дозы экзогенного 20Е, активирующей компенсаторную реакцию на его поступление в организм, и особенностей этой реакции. В лабораторном эксперименте по 50 недавно вылупившихся рабочих особей помещали в клетки размером 120×105×40 мм с пустым сотом в трех-четырехкратной повторности на вариант корма. Кормом служил 50 % сахарный сироп с добавками 20Е в концентрации от 4×10-10 до 1×10-5 моль/л (суточная доза от 0,01 до 250 пмоль на пчелу), в контроле в сироп 20Е не добавляли. В течение 7 сут клетки находились в гигротермостате при температуре 35,0±0,5 °С и относительной влажности воздуха 50±5 %. Наименьшая исследованная суточная доза 20Е (0,01 пмоль на пчелу) не оказала достоверного влияния на размеры фолликулов глоточной железы. Максимальное уменьшение диаметра фолликулов глоточной железы (на 1/4, p 1/5, p -10 до 2×10-9 моль/л (или дозы с 0,01 до 0,05 пмоль на пчелу в сутки). Таким образом, в зависимости от дозы 20Е его биологическое действие меняется вплоть до смены эффекта на противоположный. Сделано предположение, что при поступлении с кормом 20Е в суточной дозе 0,05 пмоль на пчелу происходит активация ферментного окисления 20Е, обусловливающая защитный эффект за счет снижения концентрации 20Е в гемолимфе.
Медоносная пчела, 20-гидроксиэкдизон, гормон линьки, доза-эффект, глоточная железа, пролин, запасание нектара
Короткий адрес: https://sciup.org/142244128
IDR: 142244128 | УДК: 638.1:591.1:577.171.7 | DOI: 10.15389/agrobiology.2024.6.1160rus
About the dose-dependent effect of exogenous 20-hydroxyecdysone on the hypopharyngeal gland and behavior of adult bees Apis mellifera L.
20-Hydroxyecdysone (20E) is a biologically active substance that has multiple effects on both vertebrates and invertebrates. In arthropods, the steroid hormone 20E is primarily known as the molting hormone in imaginal phases; relatively recent studies indicate the activity of 20E on imago. However, the results of studies of its effects are contradictory, and an attempt to commercially use 20E preparations in beekeeping was unsuccessful, probably due to the tolerance of Apis mellifera L. to exogenous 20E due to increased metabolism or activation of the blood-brain barrier. In the present work, in a model experiment, we have shown that the biological effect of 20E on young bees is manifested in a dose-dependent effect on food storage in honeycomb cells, on the development of the pharyngeal gland, and the accumulation of proline secreted by it in honey. The aim of the study was to identify the dose of exogenous 20E that activates the compensatory reaction to its intake into the body, and peculiarities of this reaction. In a laboratory experiment, 50 newly emerged workers each were supplied with 50 % sugar syrup, an empty comb and kept in 120×105×40 mm cages in a hygrothermostat at 35.0±0.2 °С and relative air humidity 50±5 % for 7 days. The sugar syrup in the experiment contained the additive 20E at a concentration of 4×10-10 to 1×10-5 mol/l with daily dose from 0.01 to 250 pmol per bee. The lowest studied daily dose of 20E (0.01 pmol per bee) does not have a significant effect on the size of the hypopharyngeal gland acini. The maximum reduction (by 1/4, p 1/5, p -10 to 2×10-9 mol/l (from 0.01 to 0.05 pmol/bee per day). We suggest that 20E fed at a daily dose of 0.05 pmol per bee activates oxidation of 20E, causing a decrease in the 20E accumulation in the hemolymph and a sharp change in the influence, including change to the opposite biological effects.
Текст научной статьи О дозазависимом влиянии экзогенного 20-гидроксиэкдизона на глоточную железу и поведение взрослых пчел Apis mellifera L.
Один из механизмов регуляции размера пчелиной семьи — каннибализм, когда рабочие особи поедают часть развивающихся личинок. Активность каннибализма подвержена сезонной изменчивости: весной со стадии яйца до имаго доживает 75-80 % пчел, летом — 80-90 %, осенью — 50-75 % (22). Содержание 20Е у куколок рабочих пчел и трутней достигает максимальных значений на стадии розовых глаз — 1441,04±407,17 пмоль/мл (23) или 800 пг/мкл гемолимфы (24) (примерно 1,5½10-6 моль/л). Можно предполагать, что устойчивость к высокому уровню экзогенного 20Е эволюционно возникла у предков пчелиных — хищных и паразитических видов перепончатокрылых.
Известны несколько путей инактивации экдистероидов у насекомых: 3-эпимеризация, 22-фосфорилирование, 22-этерификация и 26-гидроксилирование (25, 26). Последний вариант с образованием (20-гидрокси)-экдизоновый кислоты является основным (26). Ген Cyp18a1 , кодирующий цитохром P450-зависимую монооксигеназу, которая катализирует эту реакцию, сохранился у медоносной пчелы, несмотря на значительное сокращение генов детоксикации в ходе эволюции (27, 28). Активность фермента, окисляющего 20Е, регулируется концентрацией 20Е. Введение 20Е табачному рогатому червю Manduca sexta Linnaeus, 1763 приводит к индукции активности экдистероидной 26-гидроксилазы в митохондриях и микросомах средней кишки (29).
Между мозгом и гомолимфой медоносной пчелы существует гематоэнцефалический барьер, перенос стероидных гормонов через него осуществляется с участием полипептида EcI. Экспрессия транспортного EcI происходит в поверхностных глиальных клетках, которые образуют гематоэнцефалический барьер, и при недостатке EcI в гематоэнцефалическом барьере блокируется передача опосредованных 20Е сигналов в мозг (30).
Анализ публикаций по влиянию экзогенного 20Е на взрослых особей медоносной пчелы (5-11) показывает широкий разброс используемых концентраций, чаще очень высоких. При этом в одном исследовании, как правило, испытывается единственная концентрация, что делает полученные результаты несопоставимыми. Существующие работы с разными концентрациями 20Е, различающимися на один-два порядка, не выявили существенной разницы в действии 20Е (11). Публикаций с широким диапазоном исследованных концентраций экзогенного 20Е и оценкой действия одновременно на разные органы-мишени, в том числе головной мозг, отвечающий за поведенческие реакции, в доступной научной литературе мы не обнаружили.
В настоящей работе в модельном опыте, сопоставив биологическое действие разных концентраций 20Е, мы показали его дозозависимое влияние на поведение, развитие глоточной железы и ее функцию у молодых пчел.
Целью исследования было выявление дозы экзогенного 20Е, активирующей компенсаторную реакцию на его поступление в организм, и особенностей влияния 20Е на глоточную железу, секрецию ею пролина и поведенческие реакции пчел (запасание корма в ячейки сот).
Методика . В работе использовали медоносных пчел местной популяции Apis mellifera mellifera , для чистоты опыта пчел брали из одной семьи. Исследования выполнены в июне 2020 года.
Готовили пять вариантов углеводного корма: с концентрацией 20Е 4х10 ’ 10, 2x10 — 9 , 2x10 — 8 , 1x10 — 5 моль/л и контрольный (без 20Е). Использовали стандартный образец 20Е (ООО «Геофарма», Россия). Все варианты корма, в том числе контрольный, содержали 50 % сахарозы и 0,2 % этанола, используемого для растворения 20Е.
В эксперименте моделировали работу пчел-приемщиц. По 50 рабочих пчел в возрасте до 24 ч заселяли в клетки размером 120½105½40 мм с кормушкой с раствором сахарозы (контроль — без 20Е, 3 клетки, опыт — с 20Е от 4½10-10 до 1½10-5 моль/л, по 3-4 клетки) и пустым сотом, помещали в гигротермостат при температуре 35,0±0,5 ° С и относительной 1162
влажности воздуха 50±5 %. Условия опыта, конструкция клетки и кормушки приведены в соответствие с рекомендациями и описаниями в аналогичных сообщениях (31, 32). Через 7 сут учитывали смертность, количество взятого сиропа и запасенного корма, определяли содержание пролина в запасенном корме, исследовали анатомическое состояние глоточных желез.
Гибель пчел в 1-е сут, связанную с травмами от манипуляций при заселении в клетки, из результатов смертности исключали.
Для оценки состояний глоточных желез отбирали по три-четыре пчелы из каждой клетки, фиксировали и хранили материал в жидкости Буэна. Пчелу переносили в 70 % спирт, препарировали глоточную железу, с помощью бинокулярного микроскопа МБС-10 (ОАО ЛЗОС, Россия), цифровой камеры HAYEAR 5MP (Китай) и программы HiView 1.0 измеряли размеры 10-24 случайно выбранных фолликулов, лежащих в экваториальной проекции (всего по 160-215 фолликулов на вариант опыта).
Содержание пролина в меде определяли по ГОСТ Р 54947-2012 («Мед. Метод определения пролина». М., 2013). Общее количество секретируемого пролина рассчитывали, как произведение количества запасенного продукта на содержания в нем пролина.
Вычисляли средние значения ( M) и стандартные ошибки средних (±SEM), а также коэффициент вариации ( Cv , %) и корреляции ( r ). Достоверность различий оценивали, используя t -критерий Стьюдента. Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel.
Результаты . Количество потребленного сиропа (разница между взятым из кормушки и отложенным в ячейках сотов) во всех вариантах опыта практически не различалось и в среднем в сутки на пчелу составило 27,7±1,4 мг, или 22,0±1,1 мкл. Суточные дозы 20Е по вариантам опыта составили: минимальная — 0,01; низкая — 0,05; промежуточная — 0,5; максимальная — 250 пмоль на пчелу при концентрациях 20Е в сахарном сиропе соответственно 4½10 - 10, 2½10 - 9, 2½10 - 8 и 1½10 - 5 моль/л.
Смертность пчел при потреблении чистого сахарного сиропа к концу опыта составила 4,7±3,7 %. Добавление в сироп 20Е достоверно не повлияло на смертность, что соответствует результатам аналогичных работ (5). Однако при максимальной исследованной дозе показатель смертности повышался до 17,1±4,5 % (p = 0,10).
Рис. 1. Размеры фолликулов глоточной железы у пчел Apis mellifera mellifera в зависимости от суточной дозы 20Е: а — длина, б — диаметр ( n = 160215, M ±SEM, модельный опыт; Пермский край, 2020 год).
происходит частичное восстановление
Минимальная доза 20Е не оказывала достоверного влияния на линейные размеры фолликулов глоточной железы (рис. 1). Однако имело место небольшое (р < 0,05) снижение соотношение длины фолликула и его диаметра, что характерно для возрастных изменений глоточной железы, связанных с повышением ее секреторной активности (33). При увеличении количества полученного 20Е резко уменьшался как диаметр (на 1/4), так и длина фолликулов (на 1/5). Однако при дальнейшем повышении дозы размеров фолликулов глоточной железы. Максимальная доза привела к уменьшению диаметра фолликулов. Все различия линейных размеров по сравнению с контролем или вариантом с минимальной дозой, а также с предыдущим вариантом опыта были статистически значимы (р < 0,001), длина фолликула в варианте с максимальной дозой почти достигла контроля (р < 0,05).
Рис. 2. Секреция пролина у пчел Apis mellifera mellifera в зависимости от суточной дозы 20Е ( n = 3-4, M ±SEM, модельный опыт; Пермский край, 2020 год).
Максимальную секрецию пролина (рис. 2) отмечали при минимальной дозе 20Е, минимальную — при низкой и максимальной. Низкая доза вызвала 2-кратное снижение (p < 0,05) секреции пролина по сравнению с минимальной. Секреторная активность имела высокую корреляцию (r = 0,83) с шириной фолликулов глоточной железы.
Результаты, полученные нами для максимальной концентрации 20Е, подтверждают данные о негативном влиянии высоких доз 20Е (инъекции 3, 30 и 300 пмоль на пчелу) на размеры фолликулов глоточной железы и экспрессию генов ее секреторных белков (11). Однако нами обна- ружено существенное снижение размеров глоточной железы и секреции ею пролина при низкой дозе 20Е и ослабление эффекта при промежуточной дозе. При этом характер деформации фолликулов различен: низкая доза вызывала уменьшение размера фолликулов с сохранением пропорций, высокая — приводила к деструкции с уменьшением диаметра фолликулов и некоторым смещением максимального диаметра к верхушке фол- ликула.
Максимальная активность пчел по запасанию корма отмечалась при минимальной концентрации 20Е (4½10 - 10 моль/л) (рис. 3). В работе Н.П. Тимофеева (8) стимулирующий эффект при сборе нектара в естественных условиях обнаружен в еще меньшей концентрации — 2½10 - 11 моль/л.
Рис. 3. Перенос сахарного сиропа в соты пчелами Apis mel-lifera mellifera в зависимости от суточной дозы 20Е ( n = 34, M ±SEM, модельный опыт; Пермский край, 2020 год).
Однако последовавшее 5-кратное увеличение дозы привело 2-кратному снижению этого показателя (p < 0,05).
Далее рост дози-woo ровки 20Е сопровождался повышением вариабельности количества за пасенного корма в сотах (Cv от 16,8 % в контроле до 125,4 % при макси- мальной дозе 20Е). Перенос корма в ячейки сотов — социальное поведение, характерное для группы пчел. Однако, вероятно, на этот процесс влияют пчелы-лидеры или переносом корма в соты занимаются не все пчелы из группы. Отмечено (12), что у некоторых молодых пчел содержание 20Е чрезвычайно высокое — до 10-6 моль/л.
Наибольший интерес представляет обнаруженное скачкообразное уменьшение размера фолликулов, а также запасания корма и секреции пролина при повышении дозы с минимальной до низкой. Принимая, что концентрация 20Е в гемолимфе молодых рабочих пчел (возраст 1-5 сут) находится в пределах 0,01-0,025 пмоль/мкл (34, 35) при количестве гемолимфы у пчелы 15 мкл (36), фоновое количество эндогенного 20Е составляет в среднем 0,25 пмоль на одну пчелу. Таким образом, полученная в сутки минимальная доза 0,01 пмоль экзогенного 20Е равняется примерно 1/ 25 части эндогенного. Можно предположить, что такое количество экзогенного 20Е беспрепятственно проникает через пищеварительный тракт и гематоэнцефалический барьер, оказывая значительное стимулирующее влияние на глоточную железу и головной мозг пчел, а при пятикратном увеличение суточной дозы, соответствующей примерно 1/ 5 от эндогенного 20Е, происходит активация 20Е-оксидазы, снижающей общий титр 20Е.
При суточной дозе 0,5 пмоль на пчелу некоторое восстановление размеров фолликулов глоточной железы и вариабельности биологического действия, вероятно, обусловлено слишком высокой нагрузкой на ферменты, метаболизирующие 20Е. Поскольку характер изменения параметров глоточной железы и поведения совпадают, можно предположить отсутствие влияния гематоэнцефалического барьера, по крайней мере, в минимальной и низкой дозе 20Е.
В целом следует отметить, что, несмотря на кажущуюся толерантность взрослых пчел, 20Е, получаемый при посещении некоторых медоносных растений (17, 21) и имеющем место каннибализме (22), значительно влияет на поведение, состояние и работу глоточных желез медоносной пчелы. Предложенная ранее V. Corby-Harris с соавт. (11) опосредованная 20Е модель регуляции активности глоточной железы требует пересмотра, поскольку характер влияния 20Е на ее развитие и функционирование более сложный. Так, мы выявили два максимума концентрации 20Е, оказывающие негативное действие на размеры и секреторную активность глоточной железы, скачкообразное уменьшение как ее размеров и секреторной активности, так и поведения по запасанию углеводного корма в соты, сопровождаемые изменением эффекта на противоположный. Можно предполагать активацию ферментов, окисляющих 20Е при его поступлении с кормом в дозе от 0,01 до 0,05 пмоль на пчелу в сутки (соответствующие концентрации 20Е в сахарном сиропе — от 4½10 - 10 до 2½10 - 9 моль/л). Тогда низкая эффективность выпускаемого ранее препарата ВЭСП объясняется слишком высокой концентрацией активного вещества в рабочем растворе (2½10 - 8 моль/л), оказывающей негативное действие на глоточную железу и проявление кормового инстинкта. Отмеченное ранее повышение кормособирающей активности пчел при очень малом количестве экзогенного 20Е (2½10 - 11 моль/л) (8) обусловлено стимулированием деятельности пчел — приемщиц нектара. Следовательно, использования препаратов 20Е в пчеловодстве с целью повышения интенсивности сбора меда представляет интерес.
Также отметим, что наши исследования проведены на небольших группах пчел при клеточном содержании в лабораторных условиях и представляют собой первый этап в изучении 20Е как биологического стимуля-1165
тора на полноценных пчелиных семьях в условиях пасек. Предполагаемый механизм смены знака эффекта требует подтверждения в экспериментах по анализу содержания 20Е в гемолимфе и генной экспрессии.
Итак, показано, что наименьшая исследованная суточная доза 20-гидроксиэкдизона (20Е) (0,01 пмоль на пчелу) не оказала достоверного влияния на размеры фолликулов глоточной железы. Диаметр фолликулов глоточной железы максимально уменьшался (на 1/ 4 , p < 0,001) при максимальной и низкой дозе 20Е (соответственно 250 и 0,05 пмоль на пчелу в сутки). Минимальную длину фолликулов (уменьшение на 1/ 5 , p < 0,001) отмечали только при низкой дозе 20Е (0,05 пмоль на пчелу в сутки), при дозе 250 пмоль на пчелу в сутки фолликулы вытягивались и почти достигали контрольной длины (p < 0,05). Размеры фолликулов при промежуточной суточной дозе (0,5 пмоль на пчелу) имели промежуточные показатели между таковыми для 0,05 пмоль на пчелу в сутки и контролем при достоверных отличиях от этих значений (p < 0,001). Также выявлено скачкообразное снижение (в 2 раза, p < 0,05) секреции пролина и активности пчел по запасанию корма при повышении дозы 20Е с 0,01 до 0,05 пмоль на пчелу в сутки.
