О влиянии препаратов для наружного лечения акне на состояние процессов свободнорадикального окисления

Основными звеньями патогенеза акне в настоящее время признаны следующие взаимосвязанные факторы: ретенционный гиперкератоз устья волосяного фолликула, гиперсекреция кожного сала, размножение P.acnes, развитие перифоллику-лярной воспалительной реакции [2, 16, 18].

Известно, что усиление свободнорадикальных процессов и развитие состояния «окислительного стресса» (ОС) являются одним из патогенетических звеньев воспалительных процессов любого генеза. При этом снижается буферная емкость антиоксидантной защиты и нарушается ее мобилизация в ответ на повышение активности проокси-дантной системы [8, 17, 21]. Наиболее мощный поток первичных свободных радикалов и вторичных продуктов их превращения исходит из гранулоцитов и макрофагов как резидентных, так и мигрирующих в кожу [11]. Вырабатываемые нейтрофилами активные формы кислорода (АФК) принимают участие в повреждении и деструкции стенок фолликула при акне [3, 11]. Кроме того, АФК инициируют процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ), сопровождающиеся образованием токсических перекисных продуктов [13].

Однако следует учитывать, что АФК контролируют ключевые метаболические процессы, являясь сигнальными молекулами. Генерируемые АФК влияют на процессы мобилизации компонен- тов антиоксидантной защиты (АОЗ) и на синтез соединений, стимулирующих генерацию оксидантов. Это способствует поддержанию сбалансированного соотношения между антиоксидантной и прооксидантной системами (АОС и ПОС) [8].

Поиск средств, позволяющих поддерживать скорость свободнорадикального окисления (СРО) на оптимальном уровне и контроль за состоянием данного процесса, может иметь определенное значение в лечении и профилактике осложнений акне.

Перспективным методом исследования СРО является регистрация хемилюминесценции (ХЛ) – свечения, возникающего при взаимодействии свободных радикалов (СР) [10, 14].

Цель исследования – изучение влияния наружных препаратов для лечения угревой болезни на процессы СРО in vitro.

Материал и методы исследования. В исследовании изучалось влияние лекарственных препаратов, используемых для наружного лечения акне, на СРО in vitro в простых модельных системах, имитирующих наиболее распространенные реакции СРО в организме – генерацию активных форм кислорода и процессы перекисного окисления липидов. Также in vitro изучали влияние препаратов на спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию (ЛЗХЛ) гепаринизированной крови.

Регистрация свечения проводилась на приборе «хемилюминомер-ХЛМ-003» (Межвузовская лаборатория технических систем медико-биологических исследований, БГМУ, УГАТУ, Россия). Изучение влияния на генерацию АФК проводилось в модельной системе цитрат – фосфат – люминол (ЦФЛ). Исследование влияния на процессы ПОЛ проводилось в системах липосом из куриного желтка. Во всех системах процессы СРО инициировали внесением 1 мг 25 мМ сернокислого железа, конечная концентрация Fe2+ в среде инкубации составила 2,5 мМ. При этом в модельной системе ЦФЛ происходило образование АФК, аналогичных тем, которые вырабатываются клетками крови при фагоцитозе [14]. В другой модельной системе из желточных липопротеидов ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав липидов, окислялись и образовывали продукты перекисного окисления. Исследуемые препараты разводили в диметилсульфоксиде для получения 5 %-ных растворов и добавляли по 0,01 и 0,1 мл полученного раствора к 10 мл тест-системы, в которой инициировали реакции СРО. Предварительно измеряли собственную хемилюминесценцию системы без добавления исследуемых лекарственных веществ, принимая эти показатели за контрольные. АОА препаратов определяли по угнетению ХЛ модельной системы и пересчитывали в процентах от контроля.

Известно, что свечение цельной крови, в основном, обусловлено свечением нейтрофильных гранулоцитов, в которых в результате ферментативного окисления возникают активные метаболиты кислорода (гидроксильный радикал, гипохлорид, оксид азота и др.), определяющие их функциональную активность и микробицидные свойства [13, 14, 17]. Для изучения влияния препаратов на спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию гепаринизированной крови отбирали 0,1 мл цельной гепаринизированной крови (из расчета 50 ед. гепарина на 1 мл крови), смешивали с 0,01 мл приготовленного раствора или с физиологическим раствором в том же объеме в качестве контроля, инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 10 мин, разводили в 2 мл физиологического раствора с люминолом.

Исследовано влияние 10 препаратов (1-изотретиноин + эритромицин гель, 2-фузидовая кислота крем, 3-клиндамицин гель, 4-азелаиновая кислота гель, 5-гиалуронат цинка гель, 6-адапален гель, 7-бензоил пероксид гель, 8-эритромицин + + цинка ацетата дигидрат лосьон, 9-адапален + + клиндамицин гель, 10-эпигаллокатехин-3-галлат гель), используемых при наружном лечении acne vulgaris на СРО в модельных системах in vitro и в крови.

Полученные данные обработаны статистически с помощью пакета компьютерных программ «Statistica for Windows (release 5.0)». На основании величины t-критерия Стьюдента и степени свободы n находили вероятность различия p. Достоверными считали данные, для которых вероятность ошибки (p) была меньше 0,05 (p < 0,05).

Результаты и обсуждение. На рис. 1 представлена типичная запись ХЛ модельной системы, в которой введение инициатора окисления – солей железа вызывает образование АФК и развивается ХЛ. Из рисунка видно, что введение инициатора сопровождается быстрой вспышкой, за которой следует латентный период, переходящий в медленную вспышку.

Наиболее информативными показателями являются светосумма и максимальная светимость.

Добавление в данную систему классического антиоксиданта мексидола вызывало дозозависимое угнетение свечения, уменьшение светосуммы свечения и амплитуды медленной вспышки. По степени изменения ХЛ при действии различных препаратов судили об их влиянии на генерацию активных форм кислорода [14].

Изменение интенсивности ХЛ модельных систем и крови при добавлении исследованных препаратов приведены в таблице.

Исследованные препараты в той или иной степени вызывали угнетение ХЛ в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода. При этом отмечалось уменьшение показателей светосуммы и максимальной светимости.

Рис. 1. Типичная запись ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК: 1 – контроль, 2 – добавлено 0,0001 мг/мл мексидола, 3 – 0,001 мг/мл мексидола, 4 – 0,01 мг/мл мексидола, t – длительность ХЛ (мин), I – интенсивность ХЛ (отн. ед.)

Проблемы здравоохранения

Изменение светосуммы и максимальной интенсивности ХЛ модельной системы, генерирующей АФК, имитирующей ПОЛ и крови при добавлении исследованных препаратов

№	Препарат	Объем (мл)	Модель АФК		Модель ПОЛ		Кровь
			св.	I max	св.	I max	св.	I max
1	Изотретиноин+ эритромицин гель	0,01	53,4	50,3	66,3	66,2	68,2	74,1
		0,1	41,2	45,5	101,0	99,1	–	–
2	Фузидовая кислота крем	0,01	49,6	72,6	94,7	94,7	84,2	87,8
		0,1	58,7	75,5	89,5	90,5	–	–
3	Клиндамицин гель	0,01	60,2	60,5	74,0	78,4	80,6	79,4
		0,1	68,6	67,1	102,9	72,3	–	–
4	Азелаиновая кислота гель	0,01	50,4	53,3	105,3	103,3	65,6	74,0
		0,1	34,7	35,3	107,1	104,7	–	–
5	Гиалуронат цинка гель	0,01	52,3	50,7	98,8	107,1	58,1	59,5
		0,1	69,4	62,9	98,4	99,7	–	–
6	Адапален гель	0,01	63,4	73,1	103,0	101,6	53,1	59,9
		0,1	43,9	52,1	98,0	97,0	–	–
7	Бензоил пероксид гель	0,01	53,7	61,7	93,6	93,5	57,9	61,3
		0,1	43,4	54,5	112,0	107,1	–	–
8	Эритромицин + цинка ацетата дигидрат лосьон	0,01	39,3	44,9	65,4	39,1	62,0	86,4
		0,1	72,1	58,7	63,9	36,2	–	–
9	Адапален + клиндамицин гель	0,01	43,1	55,1	105,3	71,8	55,0	71,4
		0,1	41,5	39,5	101,3	65,1	–	–
10	Эпигаллокатехин-3-галлат гель	0,01	27,4	35,3	20,3	4,4	47,6	14,2
		0,1	27,1	23,4	19,3	3,5	–	–

Примечание. Интенсивность свечения модельных систем и крови до добавления исследованных препаратов принята за 100 %. Приведены средние данные 10 измерений. * – отмечены достоверные отличия (p < 0,05), св. – светосумма, I max – максимальная светимость.

Степень подавления ХЛ свидетельствовала о выраженности влияния препаратов на генерацию АФК в данной модельной системе. Максимальный эффект был выявлен у эпигаллокатехин-3-галлата.

На рис. 2 представлены данные по изменению светосуммы свечения в зависимости от дозы препарата. Со снижением концентрации исследованных препаратов угнетение ХЛ становилось менее выраженным, что свидетельствует об их дозозависимом эффекте.

В модельной системе ПОЛ (см. таблицу) эритромицин + цинка ацетата дигидрат и эпигаллока-техин-3-галлат значительно подавляли ХЛ. Остальные исследованные препараты практически не влияли на ПОЛ.

При этом увеличение концентрации препаратов также влекло за собой увеличение степени подавления ХЛ (рис. 3).

В гепаринизированной крови (см. таблицу) все исследованные препараты подавляли образование

Рис. 2. АОА исследованных препаратов при добавлении 0,01 и 0,1 мл 5 %-ного раствора препарата в диметилсульфоксиде к 10 мл тест-системы, генерирующей

АФК (светосумма в процентах от контроля)

Рис. 3. АОА исследованных препаратов при добавлении 0,01 и 0,1 мл 5 %-ного раствора препарата в диметилсульфоксиде к 10 мл тест-системы ПОЛ (светосумма в процентах от контроля)

АФК. Максимальный антиоксидантный эффект был выявлен у эпигаллокатехин-3-галлата (рис. 4).

Соотношение АОС и ПОС в тканях может меняться в зависимости от состояния организма, влияния различных факторов внешней среды. В здоровом организме поддерживается сбалансированное соотношение между АОС, ПОС и самими компонентами АОЗ [8].

Рис. 4. АОА исследованных препаратов при добавлении 0,01 мл 5 %-ного раствора препарата в диметилсульфоксиде к 0,1 мл цельной гепаринизированной крови и к 2 мл физиологического раствора с люминолом (светосумма в процентах от контроля)

Известно, что многие широко используемые в практике лекарственные средства могут влиять на СРО непосредственно или создают благоприятные условия для изменения скорости окисления в организме [14]. Характер воздействия веществ на СРО зависит от ряда факторов: свойств препарата, дозы, длительности применения и т. д., может существенно отличаться в норме и при патологии, когда развивается несостоятельность механизмов, поддерживающих скорость окисления на постоянном уровне.

При этом некоторые из препаратов обладают прямым про- или антиоксидантным действием как in vitro, так и in vivo, непосредственно взаимодействуя с радикалами и продуктами их окисления. Другие проявляют эти свойства только при введении в организм, включаясь в метаболизм и превращаясь в активные соединения, или создают благоприятные условия для изменения СРО.

Радикалы активных форм кислорода (АФК) обладают микробицидным действием. Недостаток их продукции сопровождается генерализацией микробной инвазии и, наоборот, будучи в избытке, АФК могут поддерживать асептический воспалительный процесс [13]. Они взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами, инициируют процессы свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4]. Накопление недо-окисленных перекисных продуктов приводит к изменению сосудистого тонуса, нарушению проницаемости мембранного барьера, а также к активации лизосомальных ферментов [1, 21]. Вследствие этого возникают расстройства микроциркуляции и локальный отек, усугубляются явления гипоксии, а также повышается воспалительный ответ и гибель клеток [13]. Разрушение стенки сальной железы с выходом ее содержимого в дерму также обуславливает картину воспаления, что проявляется в виде папул, пустул, узлов и кист [1, 3, 19, 22].

Таким образом, необходимо дальнейшее изучение влияния исследуемых препаратов на процессы СРО для получения возможности оптимизации тактики лечения пациентов с угревой болезнью и дифференцированного подхода к назначению наружных лекарственных препаратов с заранее заданными свойствами. Впоследствии возможно использование более сложных, биологических моделей.

Выводы

• 1.    Полученные данные свидетельствуют об антиоксидантной активности всех исследованных препаратов в модельной системе, генерирующей АФК, аналогичные тем, которые вырабатываются гранулоцитами и макрофагами при воспалительных реакциях.

• 2.    В модельной системе ПОЛ антиоксидантной активностью обладали эритромицин+ цинка ацетата дигидрат и эпигаллокатехин-3-галлат, остальные препараты не оказывали значительного влияния на ХЛ.

• 3.    В гепаринизированной крови все исследованные препараты подавляли образование АФК.

• 4.    Максимальная антиоксидантная активность во всех проведенных исследованиях выявлена у эпигаллокатехин-3-галлата. Эритромицин + цинка ацетата дигидрат также проявляет значительную антиоксидантную активность в модельной системе ПОЛ.

• 5.    Применение лекарственных препаратов с учетом их воздействия на процессы свободнорадикального окисления может позволить повысить эффективность терапии и сократить сроки лечения acne vulgaris, однако результаты данной работы требуют дальнейшего продолжения изучения влияния исследуемых препаратов на процессы свободнорадикального окисления in vitro и in vivo.