О возможности использования флуориметрического метода для оценки качества молока

Современные тенденции развития доильной техники направлены на создание устройств и приборов, обеспечивающих мониторинг качества продукции и здоровья коров при каждом доении животных. Информационные и точные наукоемкие технологии позволяют создавать системы управления стадом, в банке баз данных которых хранится информация по удоям и электропроводности молока каждой коровы, информация об охоте коровы и др.

Однако трудность заключается в том, что практически нет технических средств, выпускаемых промышленностью, оценивающих качественные показатели молока непосредственно в процессе доения. Это позволило бы расширить возможности племенной работы с помощью ЭВМ, улучшить кормление благодаря точному составлению рационов, выявлять нарушения функции вымени и здоровья коров, отслеживать качество производимого молока.

При анализе методов и технических средств, используемых для контроля качественных показателей молока [1], выявлен перспективный метод, основанный на измерении интенсивности люминесценции, называемый флуориметрией.

При проведении настоящих исследований ставилась цель - определить влияние качественных показателей молока на интенсивность его люминесценции в оптическом диапазоне длин волн.

Согласно современным представлениям о строении вещества, атомы всех элементов состоят из положительно заряженных ядер и из окружающих их электронов. При поглощении атомом кванта света один из его внешних электронов как бы удаляется от ядра, тем самым увеличивается энергетический запас атома за счет поглощенной световой энергии на величину поглощенного кванта.

Приобретенный таким образом избыток энергии не сохраняется длительно в молекулах и атомах; отдача или размен его может протекать различными путями. Например, вещества, поглощая лучистую энергию, начинают светиться. При поглощении ультрафиолетового света начинается переход электронов с основного энергетического уровня So на более высокие энергетические уровни (Si и S2), причем поступающая извне избыточная энергия возбуждения может быть поглощена молекулой с переходом в возбужденное состояние только в том случае, если ее величина равна разнице энергий основного (So) и одного из возбужденных состояний данной молекулы [1].

По физическому составу молоко представляет собой сложнейшую полидис-персную систему, содержащую множество взаимосвязанных структурных образований. К таким структурам относится эмульсионная дисперсная система из жировых шариков. Другая структурная система -коллоидная. Она состоит из разных белковых частичек размером 0,2-1 мкм. В состав молока входит еще более дробная система - истинные растворы из разрозненных молекул и атомов.

Молочный жир представляет собой сложный эфир трехатомного спирта глицерина и жирных кислот. Молочный жир, полученный из молока животных разного возраста, в зависимости от корма, стадии лактации и разных условий содержания, имеет неодинаковый состав жирных кислот, следовательно, и различные физико-химические свойства.

Белки молока, в состав которых входят ароматические аминокислоты — триптофан, тирозин и фенилаланин, обладают люминесценцией в ультрафиолетовой области спектра [2]. Индивидуальный спектр люминесценции каждой из этих аминокислот различается по положению максимума излучения. Так как жировые шарики молока покрыты белково-липоидной оболочкой, уместно предположить, что при облучении пробы молока излучением в ультрафиолетовой области спектра можно наблюдать люминесценцию оболочек жировых шариков. Причем интенсивность люминесценции будет прямо пропорциональна количеству жировых шариков в молоке, то есть содержанию жира.

Молоко содержит соматические и эпителиальные клетки, а как известно, любая клетка живого организма обладает собственной люминесценцией, которая обязана своим происхождением различным компонентам ее структуры и метаболизма. Количество люминесцирующих эндогенных соединений в клетках велико.

В молоке содержатся витамины: А, РР, В2, Вц Bn, D, Е, С. Из них яркой флуоресценцией обладает витамин В 2 [2].

Исходя из того что молоко представляет собой многокомпонентную смесь, можно предположить, что интенсивность поглощенного молоком возбуждающего люминесценцию излучения будет состоять из суммы интенсивностей поглощенного излучения отдельными компонентами молока.

Согласно закону Ламберта-Бугера-Бера, интенсивность поглощенного молоком излучения, с учетом того, что доля поглощаемого молоком излучения мала и составляет не более 5% падающего на объект излучения, будет описываться уравнением

ехап ^вит 1 ост

где 1_О - интенсивность падающего на вещество возбуждающего люминесценцию излучения;

г._ж — молярный коэффициент поглощения жировыми шариками молока;

С_ж - концентрация жировых шариков в молоке;

г^ - молярный коэффициент поглощения клетками молока;

С^ - концентрация клеток в молоке;

£б - молярный коэффициент поглощения белком молока;

Со - концентрация белка в молоке;

е_сши — молярный коэффициент поглощения витаминами молока;

Саит - концентрация витаминов в молоке;

е_ост - молярный коэффициент поглощения остальными компонентами молока, включая воду;

С ост - концентрация остальных компонентов молока, включая воду;

• d — длина оптического пути, возбуждающего люминесценцию излучения в веществе;

• к - квантовый выход люминесценции вещества.

Эта формула показывает зависимость интенсивности люминесценции молока от содержания в нем жира, белка, витаминов, клеток и других составляющих, но ввиду разнообразия структурных образований в молоке и большой вариабельности коэффициентов преломления этих образований не существует удовлетворительного теоретического подхода, позволяющего рассчитать рассеяние в столь сложной полидис-персной среде. В то же время размеры, форма и коэффициент преломления частиц, входящих в молоко, меняясь в широком диапазоне, определяют рассеивающие свойства молока [1, 2]. Поэтому зависимость интенсивности люминесценции молока от содержания в нем жира, соматических клеток, плотности и СОМО определяли эмпирическим путем.

Эксперименты по изучению влияния состава и некоторых свойств молока (жир, СОМО, плотность, соматические клетки) на интенсивность его люминесценции в оптическом диапазоне длин волн для выявления возможности использования флуориметр и ческого метода проводили следующим образом.

Пробы молока получали во время утреннего доения путем сдаивания первых порций молока в объеме 150-200 г. Первые порции молока отбирались ввиду того, что в них находится большее количество соматических клеток, чем в средних и последних порциях молока. Каждая проба молока делилась на три части.

Контрольные качественные показатели проб молока, такие как содержание жира, сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО), плотность, определяли в первой пробе ультразвуковым анализатором «Лак-тан 1-4». Содержание соматических клеток во второй пробе молока определяли прибором «Соматос».

Третья проба молока исследовалась на спектрофлуорофотометре Shimadzu RF-510. Проба молока с температурой 23 °C и объемом 1 см3 заливалась в кювету.

Длина волны возбуждения проб молока составляла 304 нм. В диапазоне от 325 до 750 нм происходило сканирование. Спектры люминесценции записывались на бумажную ленту. Всего было оценено 26 проб молока разного качества.

Данные обрабатывались на ПК методами математической статистики. При анализе были получены средние арифметические дисперсии, средние квадратические отклонения интенсивности люминесценции молока на разных длинах волн.

В качестве примера на рисунке 1 представлены четыре спектрограммы, за писанные для проб молока из разных долей вымени коровы № 524.

Рис. 1. Спектрограммы люминесценции проб молока из разных долей вымени коровы № 524

Доли вымени на рисунке 1 обозначены следующим образом: ПП - правая передняя, ЛП - левая передняя, ПЗ - правая задняя, ЛЗ - левая задняя доли вымени.

Из рисунка 3 видно, что характер кривых интенсивности люминесценции проб молока из разных долей вымени одной и той же коровы одинаков. Результаты анализов молока обрабатывались следующим образом.

Для оценки связи между интенсивностью люминесценции молока и компонентами молока, такими как содержание жира, СОМО, число соматических клеток, а также плотность вычислялись коэффициенты корреляции (табл.) и оценивалась их достоверность по критерию Стьюдента.

Анализ данных таблицы показывает, что между интенсивностью люминесценции проб молока и плотностью молока, а также между интенсивностью люминесценции проб молока и содержанием соматических клеток корреляция отсутствует.

Между интенсивностью люминесценции проб молока и содержанием в них СОМО наивысший коэффициент корреляции наблюдается на длине волны 562,5 нм и равен -0,55. Наибольшая связь между интенсивностью люминесценции молока и содержанием в нем жира проявляется для волн длиной 487,5 нм, 500 нм и 512 нм, где коэффициенты корреляции принимают значения -0,71,-0,71 и -0,7 соответственно.

Достоверность коэффициентов корреляции проверена по критерию Стьюдента. Коэффициенты корреляции между интенсивностью люминесценции проб молока и содержанием в них жира оказались значимыми в диапазоне длин волн 325...740 нм, где нулевая гипотеза опровергается на 5% уровне значимости, на 1% уровне значимости нулевая гипотеза опровергается в диапазонах длин волн 650...662 нм, 425...544 нм и 362...368 нм; на 0,1% уровне значимости - в диапазонах длин волн 487...540 нм и 462...472 нм.

Расчетные значения коэффициентов корреляции между интенсивностью люминесценции молока и его компонентами

№ п/п	Длина волны сканирования, нм	Коэффициенты корреляции между интенсивностью люминесценции проб молока и
		СОМО	плотностью	содержанием жира	числом соматических клеток
1	750	-0,47	-0,16	-0,39	-0,03
2	737	-0,49	-0,14	-0,47	-0,02
3	650	-0,41	-0,01	-0,59	-0,13
4	637	-0,51	-0,17	-0,44	-0,11
5	575	-0,48	-0,12	-0,50	-0,01
6	562	-0,55	-0,24	-0,36	-0,04
7	550	-0,49	-0,16	-0,42	-0,03
8	544	-0,43	-0,03	-0,57	-0,04
9	537	-0,38	0,05	-0,66	-0,18
10	525	-0,45	0,00	-0,66	-0,06
11	512	-0,43	0,03	-0,70	-0,10
12	500	-0,39	0,07	-0,71	-0,08
13	487	-0,31	0,13	-0,71	-0,06
14	482	-0,27	0,10	-0,59	-0,11
15	479	-0,38	0,05	-0,66	-0,05
16	475	-0,35	0,07	-0,65	-0,04
17	472	-0,29	0,13	-0,67	-0,10
18	470	-0,27	0,15	-0,68	-0,08
19	462	-0,26	0,15	-0,67	0,00
20	450	-0,30	0,10	-0,64	-0,01
21	445	-0,31	0,09	-0,63	-0,01
22	437	-0,32	0,07	-0,60	-0,05
23	412	-0,52	-0,18	-0,43	-0,06
24	400	-0,47	-0,14	-0,43	-0,06

Коэффициенты корреляции между интенсивностью люминесценции молока и содержанием СОМО оказались значимыми в диапазонах длин волн 544.. .750 нм, 512..525 нм и 375...412 нм, где нулевая гипотеза опровергается на 5% уровне значимости, на 1% уровне значимости нулевая гипотеза опровергается при длине волны сканирования образца 562 нм.

Для выявления характера зависимости интенсивности люминесценции молока от содержания в нем жира построены графики интенсивности люминесценции мо лока различной жирности при длинах волн сканирования в диапазонах 487...540 нм и 462...472 нм для всего массива данных. В качестве примера на рисунке 2 показана зависимость интенсивности люминесценции молока от содержания в нем жира при сканировании пробы молока на длине волны 500 нм, аппроксимируемая полиномом вида у = -0,017.x4 + 0,18.x3 - 0,66.x2 + 0,88.x+0,12, где х - содержание жира, при этом величи на достоверности аппроксимации R" равна 0,7.

Содержание жира, %

Рис. 2. Зависимость интенсивности люминесценции молока от содержания в нем жира при возбуждении проб молока излучением с длиной волны 304 нм и сканировании образца на длине волны 500 нм

Таким образом, проведенные исследования показали, что определение числа соматических клеток и плотности молока данным методом невозможно.

Также эксперименты показали, что метод флуориметрии для контроля содержания жира в молоке может быть применен, однако наблюдаемая нелинейная зависимость интенсивности люминесценции проб молока от содержания в нем жира влечет за собой большие абсолютные погрешности по жиру — до 1%. Уменьшение погрешности возможно пу тем проведения дополнительных экспериментальных исследований.