Обоснование клинических проявлений рассеянного склероза с позиции представлений о биохимических основах его патогенеза

Согласно современным представлениям, особое место в патогенезе рассеянного склероза (РС) отводится механизмам перекисного окисления липидов и проявлениям «оксидантного стресса» [6, 13, 17].

Целью настоящего исследования явилось изучение клинических особенностей РС, а также мембрано-дестабилизирующих процессов и активности системы антиоксидантной защиты при ре-миттирующей форме заболевания.

Материалы и методы. Нами было обследовано 492 больных РС: 195 мужчин и 297 женщин с достоверным диагнозом РС согласно критериям Мак Дональда. Средний возраст - 41,1±0,43 (медиана 41 год, Q1-Q3 интервал 19,00-52,00 лет). Все пациенты были разделены на 3 группы: 1) больные ремиттирующим рассеянным склерозом (РРС) - 252 пациента (51,2%); 2) больные вторично - прогрессирующим рассеянным склерозом (ВПРС) -189 пациентов (38,4%); 3) больные первично - прогрессирующим рассеянным склерозом (ППРС) - 51 пациент (10,4%). С учетом длительности болезни у каждого больного рассчитывался показатель скорости прогрессирования (балл EDSS / длительность болезни), который выявил преобладание больных с медленным темпом прогрессирования (СП<0,3) -48,4%. Всем больным проведена оценка неврологического статуса с определением тяжести инвалидизации по шкале Куртцке, 81 больной протестирован с использованием нейропсихологических методик для оценки степени выраженности когнитивных нарушений, уровня депрессии. С этой целью использованы шкала депрессии Бека, скрининг-тест MMSE, батарея тестов для оценки лобной дисфункции, тест пяти слов и тест рисования часов. Обследование неврологического статуса и биохимические исследования осуществлялись в режиме мониторирования.

Ввиду недоступности нервной ткани для биохимического исследования в качестве модели использовали клетки периферической крови (эритроциты, лимфоциты и тромбоциты).

Исследовали следующие биохимические параметры:

• 1.    Уровень антиоксидантной защиты оценивали на основании [1, 6, 12]:

• а)    определения содержания альфа-токоферола -жирорастворимого антиоксиданта;

• б)    исследования активности супероксиддисму-тазы - фермента антирадикальной защиты;

• в)    исследования активности каталазы - фермента антиперекисной защиты;

• г)    исследования активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

• 2.    Структуру липидной фазы эритроцитарных мембран оценивали на основании определения содержания фосфолипидов в мембранах методом тонкослойной хроматографии на силикагеле и определения холестерина методом, основанном на реакции Златкиса [ 2, 12 ] .

• 3.    Активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали на основании изучения со-

• держания продуктов ПОЛ в мембранах - концентрации диеновых конъюгатов (ДК) и шиффовых оснований (ШО) [2,12].

• 4.    Исследовали фосфолипазную активность клеток крови (ФЛА2) [2].

Для проведения статистической обработки фактического материала использовали статистический пакет SAS 8,0 (SAS Inc., США).

Результаты и обсуждение:

На основе проведенного нами клинического анализа установлены некоторые демографические закономерности (табл. 1).

Таблица 1 Демографические и клинические показатели больных РС в зависимости от варианта течения М±т, Ме(Q1-Q3)

Показатель	РРС, n=252	ВПРС, n=189	ППРС, n=51
Возраст дебюта	23,1±1,1 Ме 23,00 (18,0051,00)	25,09±0,8 Ме 25,00 (18,0054,00)	33,4±0,7* ** Ме 33,00 (28,00-57,00)
Длительности заболевания, лет	4,95±0,1 5,00 (2,00-9,00)	11,4±0,3* 11,00 (7,00-19,00)	3,98±0,09 ** 4,00 (2,00-9,00)
Длительность первой ремиссии (лет)	1,5±0,2 2,00 (1,003,00)	1,3 ±0,1 1,0 (1,005,00)	-
Количество обострений за время болезни	4,2±0,3 4,00 (4,00-5,00)	4,4±0,2 4,00 (3,00-6,00)	-
Среднегодовая частота обострений	0,87±0,04 0,86 (0,50-1,50)	0,37±0,02* 0,38 (0,22-6,00)	-
Среднегодовая скорость прогрессирования	0,35±0,01 0,34 (0,26-0,68)	0,54±0,02* 0,58 (0,25-0,74)	0,79±0,009* ** 0,78 (0,56-1,76)
Примечание: Ме - медиана; (Q1-Q3) - квартили 1 и 3; * -статистически значимые различия с РРС; ** - статистически значимые различия ВПРС с ППРС

Нами выяснено, что у пациентов с более короткой первой ремиссией в дальнейшем прослеживалась более высокая частота обострений (2,97±0,32 против 1,1±0,2, р<0,0001) и более высокая скорость прогрессирования (1,64±0,13 и 0,49±0,02 соответственно, р<0,0001). Скорость прогрессирования была наибольшей в группе больных ППРС, а наименьшей в группе РРС (р=0,003). Установленная закономерность дает возможность констатировать, что первично прогрессирующий тип течения заболевания является более неблагоприятным в прогностическом отношении, чем РРС и ВПРС. Нами установлено, что средняя продолжительность времени до наступления фазы вторичного прогрессирования в наших наблюдениях составила 9,98±1,23 лет (медиана 8,00; Q1-Q3 интервал 4,0013,00 лет).

Состояние когнитивных функций при различных вариантах течения РС (MMSE) в сравнении с контрольной группой

Таблица 2

Степень когнитивной дисфункции	РРС n=44		ВПРС n=29		ППРС n=8		Итого n=81		Контрольная группа, n=20
	n	%	n	%	n	%	n	%	n	%
Норма	27	61,4*,**	7	24,1*,**	3	37,5*	37	45,7*	20	100*
Умеренная	13	29,6	13	44,8	2	25	28	34,6	0	0
Деменция легкой степени	4	9,0**	9	31,1**	2	25	15	18,5	0	0
Деменция умеренной степени	0	0	0	0	1	12,5	1	1,2	0	0

Примечание: * - достоверность статистических различий между показателями в каждой из клинических групп больных рассеянным склерозом и контрольной группой р<0,05; ** - достоверность статистических различий между РРС и ВПРС р<0,05

На основании проведенного корреляционного математического анализа связи между длительностью первой ремиссии у больных ВПРС и временем, когда была установлена фаза вторичного прогрессирования, установлена статистически значимая корреляционная связь (r=- 0,49; p<0,005), т.е. чем продолжительнее первая ремиссия, тем позднее наступает стадия вторичного прогрессирования заболевания. Проведенный нами анализ достижения событий по методу Каплана-Майера и расчет критерия Кокса дал возможность установить достоверную ассоциацию между частотой обострений и временем перехода заболевания во вторично - прогредиентный вариант течения (F=1,52; p=0,03), т.е., чем больше частота обострений, тем раньше наступает вторичнопрогредиентный вариант течения заболевания.

В ходе проведенного нейропсихологического исследования мы выявили, что когнитивные дисфункции у больных РС встречаются достоверно чаще по сравнению с группой здоровых людей, которые составили контрольную группу (табл. 2).

При этом процент пациентов без когнитивных нарушений по данным скрининг - теста MMSE закономерно уменьшается от 64,1% при РРС, до 37,5% и 24,1% при ППРС и ВПРС. Деменция умеренной степени имелась лишь в группе больных ППРС. Выявленная статистически достоверная разница по результатам оценочной шкалы MMSE между больными РС и контрольной группой (здоровые) подтверждает наличие клинически значимого дефекта когнитивных функций у больных РС и обоснованность применения данного скрининг - теста для диагностики нарушения когнитивных дисфункций у больных РС. В процессе корреляционного математического анализа определена отрицательная корреляционная связь между показателями общего балла по шкале MMSE и балла инвалидизации по шкале EDSS. Отсюда можно сделать вывод о том, что тяжесть когнитивных нарушений усугубляется при прогрессировании заболевания и достижении более высокого балла инвалидизации по шкале Куртцке.

Наличие депрессивных нарушений у больных было оценено при помощи шкалы депрессии Бека и выявлялось у 67,9% обследованных, чаще у больных ВПРС (82,8%). При ППРС и РРС частота де- прессивных нарушений представлена реже и не имеет статистически достоверных различий (62,5% и 59,1% соответственно). В структуре депрессивных расстройств у больных вторично - прогредиентным РС преобладала легкая депрессия (69,0%). У больных ремиттирующей формой РС и больных первично-прогредиентным РС легкая степень депрессии диагностировалась с одинаковой частотой (52,5% и 50% соответственно). Нами также установлена положительная корреляционная зависимость между степенью депрессии и степенью инвалидизации по шкале EDSS.

Таблица 3

Показатели активности фосфолипазы А2 и содержание продуктов ПОЛ в клетках крови больных РС в зависимости от стадии заболевания (M+m)

Величины анализируемых показателей
Здоровые,	Обострение,	Ремиссия,
n=20	n=42	n=20

Показатели в тромбоцитарных мембранах

Показатели

Фосфолипаза А2 мкмоль/мг белка	0,33+0,03	1,65+0,1*	2,05+0,2* **
ДК, нмоль/мг липидов	36,13+0,56	50,74+4,3*	52,7+0,4*
ШО, у.е. фл/мг липидов	61,5+2,97	80,79+5,9*	80,9+7,8*

Показатели в лимфоцитарных мембранах
Фосфолипаза А2 мкмоль/мл	5,75+0,57	6,86+0,3*	4,01+0,2* **
ДК нмоль/мл	37,8+1,17	68,6+0,5*	51,01+0,4* **
ШО у.е. фл	7,9+0,50	12,23+1,0*	11,92+0,9*

Показатели в эритроцитарных мембранах
Фосфолипаза А2 % гемолиза	4,43+0,21	21,6+1,7*	12,7+0,9* **
ДК нмоль/мл	48,4+3,5	158,64+8,9*	118,7+4,4* **
ШО у.е. фл	18,3+1,02	28,69+1,6*	20,9+1,8* **

Примечание: p<0,05; * - p - достоверность статистических различий между показателями у здоровых и больных РС в зависимости от стадии заболевания; ** - p - достоверность статистических различий между показателями у больных РС в стадии обострения и ремиссии.

Поскольку одной из поставленных задач являлась оценка выраженности мембрано - дестабилизирующих процессов при РС, у части больных были проведены специальные биохимические исследования. Важным показателем активности мембранодестабилизирующих процессов является уровень функциональной активности эндогенных фосфолипаз и динамика накопления липоперекисей. Изменение данных показателей в зависимости от стадии РС представлены табл. 3.

Содержание липоперекисей (ДК и ШО) статистически достоверно повышено в мембранах всех клеток крови (эритроциты, тромбоциты, лимфоциты) у больных РС в стадии обострения заболевания. В тромбоцитарных мембранах эти показатели остаются стабильно высокими и в период ремиссии. В мембранах лимфоцитов и эритроцитов содержание липоперекисей в стадии ремиссии процесса имеет тенденцию к снижению, но не достигает нормативных показателей. В период обострения заболевания наблюдается также более высокий уровень активности фосфолипазы А2, чем в период ремиссии, при этом повышение активности фермента наблюдается преимущественно в лимфоцитарных и эритроцитарных мембранах больных РС. В период ремиссии в эритроцитарных мембранах этот показатель начинает снижаться, хотя не достигает нормативных параметров, в то время как в лимфоцитарных мембранах становится даже ниже нормы [3, 9, 15]. Снижение уровня активности фосфолипазы А2 в лимфоцитах при ремиссии РС является предиктором стабилизации лимфоцитарных мембран и биохимической основой клинической ремиссии заболевания. Таким образом, уровень активности фосфолипазы А2 и содержание продуктов ПОЛ в мембранах клеток крови патогенетически значимы в возникновении обострения РС.

Одним из важнейших механизмов, регулирующих активность процессов ПОЛ является состояние системы антиоксидантной защиты в организме больного [4, 5, 7, 14]. При обострении РС статистически достоверно повышается активность каталазы в тромбоцитах больных. В состоянии ремиссии в тромбоцитарных мембранах статистически достоверно повышается активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Система антиоксидантной защиты в тромбоцитах испытывает напряжение при обострении РС, возникает несостоятельность отдельных ее звеньев (СОД и каталаза в период обострения не реагируют в достаточной степени), что является одним из факторов, лежащих в основе экзацербации заболевания. В лимфоцитарных и эритроцитарных мембранах происходит снижение активности СОД и каталазы, а степень этой депрессии закономерно усугубляется в период обострения РС [8].

Анализ показателей системы антиоксидантной защиты у больных РС в разные стадии заболевания представлен в таблице 4.

Таблица 4

Показатели активности ферментов антиоксидантной защиты и содержания а-токоферола в клетках крови больных РС в зависимости от стадии заболевания (M±m)

Показатели	Величины анализируемых показателей
	Здоровые, n=20	Обострение, n=42	Ремиссия, n=20

Показатели в тромбоцитарных мембранах

СОД, у.е. торм/мг белка	2,21±0,20	2,44±0,1	3,11±0,2* **
Каталаза мкмоль/мг белка	1,51±0,13	2,85±0,1*	3,02±0,21*
а-токоферол нмоль/мл	3,75±0,28	2,22±0,2*	2,19±0,1*

Показатели в лимфоцитарных мембранах

СОД % торм	45,4±0,51	25,21±2,03*	30,94±2,8*
Каталаза мкмоль/мл/мин	8,3±0,38	5,16±0,41*	5,81±0,36*
а-токоферол нмоль/мл	8,8±0,9	2,19±0,1*	3,1±0,09* **

Показатели в эритроцитарных мембранах
СОД % торм	45,3±2,9	24,84±0,9*	44,3±1,3**
Каталаза мкмоль/мл/мин	3,9±0,1	2,41±0,1*	3,4±0,15**
а-токоферол нмоль/мл	5,8±0,28	3,22±0,2*	5,49±0,1**

Примечание: p<0,05; * - p - достоверность статистических различий между показателями у здоровых и больных РС в зависимости от стадии заболевания; ** - p - достоверность статистических различий между показателями у больных РС в стадии обострения и ремиссии.

Таким образом, дефицит или несостоятельность отдельных звеньев системы антиоксидантной защиты создает перспективу для формирования дестабилизации клеточных мембран. Это предположение подтверждается низким уровенем а -токоферола при РС, что является результатом его активного потребления в условиях оксидантного стресса.

Активному воздействию на мембраны процессов переокисления со стороны эндогенных фосфолипаз подвергаются, прежде всего, мембранные липиды, в результате чего происходит модификация липидного бислоя клеточных мембран. Изменение липидного бислоя клеточных мембран у больных РС в зависимости от стадии заболевания представлено в таблице 5.

Анализ структуры липидной фазы мембран у больных РС на разных стадиях заболевания позволил продемонстрировать, что уровень холестерина в мембранах тромбоцитов и лимфоцитов сохраняется стабильно высоким независимо от стадии заболевания. Однако уровень общих фосфолипидов при обострении РС статистически достоверно ниже, чем в период ремиссии. В итоге интегральный показатель выраженности структурных изменений липидной фазы тромбоцитарных и лимфоцитарных мембран (отношение холестерин/фосфолипиды) в значительно большей степени изменен в стадии обострения заболевания. Но и в период ремиссии соотношение холестерин/фосфолипиды при РС не соответствует нормативным параметрам.

Таблица 5

Структура липидной фазы мембран клеток крови и содержание кальция в клетках больных РС в зависимости от стадии заболевания (M + m)

Показатели

Величины анализируемых показателей
Здоровые,	Обострение,	Ремиссия,
n=20	n=42	n=20

Показатели в тромбоцитарных мембранах
ОХ, мкмоль/мл	0,291 + 0,02	0,47 + 0,032*	0,443 + 0,03*
ОФЛ, мкмоль/мл	0,184 + 0,016	0,07 + 0,005*	0,106 + 0,01* **
ОХ/ОФЛ	1,58	6,7	4,18

Показатели в лимфоцитарных мембранах

ОХ, мкмоль/мл	0,69 + 0,12	0,85 + 0,01*	0,81 + 0,09*
ОФЛ, мкмоль/мл	0,243 + 0,011	0,095 + 0,02*	0,198 + 0,02**
ОХ/ОФЛ	2,8	8,9	4,0
ЛФХ, мкмоль/мл	0,019 + 0,001	0,04 + 0,003*	0,032 + 0,002* **

Показатели в эритроцитарных мембранах
ОХ, мкмоль/мл	1,52 + 0,04	0,56 + 0,02* **	0,89 + 0,01*
ОФЛ, мкмоль/мл	0,516 + 0,03	0,386 + 0,01*	0,312 + 0,02*
ЛФХ, мкмоль/мл	0,048 + 0,04	0,22 + 0,003* **	0,04 + 0,004*

Примечание: p<0,05; * - p – достоверность статистических различий между показателями у здоровых и больных РС в зависимости от стадии заболевания; ** - p – достоверность статистических различий между показателями у больных РС в стадии обострения и ремиссии.

Также установлено, что в различные фазы заболевания происходит накопление мембранодетергентной фракции – лизофосфатидилхолина (ЛФХ) в эритроцитарных и лимфоцитарных мембранах. При этом повышение содержания ЛФХ наиболее выражено при экзацербации заболевания. Следовательно, в период обострения заболевания степень структурной перестройки клеточных мембран значительно больше, чем в период ремиссии.

Таким образом, выявленные изменения на модели клеток крови являются базовыми, коррелируют с тяжестью клинических проявлений РС, а значит, во многом их определяют. Активация перекисного окисления липидов не только постоянный спутник заболевания, но и один из существенных патогенетических механизмов, определяющих его течение и прогноз [10, 11].