Обоснование применения физического способа предподготовки лигноцеллюлозного сырья в технологии получения кормового белка

Введение. В настоящее время растительное непищевое лигноцеллюлозное сырье является одним из основных компонентов отходов различных отраслей промышленности, сельского и лесного хозяйства. Переработка такого рода органического сырья сочетает в себе не только высокую экономическую эффективность, но и защиту окружающей среды [1, 4, 10].

Гидролиз некрахмальных полисахаридов данного лигноцеллюлозного сырья является одной из основных стадий технологий многих ценных биотехнологических продуктов, таких как кормовых белков, биотоплива, упаковочных, теплоизоляционных материалов и др. Предварительная обработка отходов позволяет увеличить доступность лигноцеллюлозы для действия кислот и/или ферментов при производстве целевых продуктов [2, 11].

В биоконверсии растительной лигноцеллюлозы используют механические, физические, химические и биологические методы предобработки сырья. Предварительная обработка позволяет увеличить доступную площадь поверхности и размер пор, снизить кристалличность и степень полимеризации лигноцеллюлозного комплекса сырья, увеличивает доступную поверхность целлюлозы для ферментативного гидролиза [3].

При этом надо отметить, что самым главным недостатком многих методов предварительной обработки лигноцеллюлозы, особенно при низких рН, является формирование различных типов ингибиторов, таких как карбоновые кислоты, фенольные соединения, фураны и другие. Несмотря на то, что эти вещества не влияют на ферментативный гидролиз, они подавляют рост микроорганизмов-продуцентов различных целевых продуктов, получаемых на основе лигноцеллюлозы растительного сырья [4, 5].

Одной из перспективных технологий, обеспечивающих значительную интенсификацию производственных процессов гидролиза растительной лигноцеллюлозы, является кавитационная обработка. Под кавитацией понимают образование заполненных паром, газом полостей или пузырьков при локальном понижении давления в жидкости до давления насыщенных паров [7]. При кавитационном воздействии длинные молекулы целлюлозы разрываются, образуются разветвленные изомерические крахмальные структуры, часть молекул подвергается гидролизу. Различают гидродинамическую кавитацию, возникающую за счет местного понижения давления в потоке жидкости при обтекании твердого тела, и акустическую кавитацию, возникающую при прохождении через жидкость акустических колебаний - ультразвука [6, 8, 9].

В связи с этим, целью данной научноисследовательской работы являлось исследование по обоснованию применения в технологии получения кормового белка способа физической предподготовки лигноцеллюлозного сырья - гидродинамической кавитации.

Материалы и методы исследований. Исследования проводились в научно-исследовательской лаборатории кафедры Биотехнологии имени профессора Н.Е. Павловской, в ЦКП «Орловский региональный центр сельскохозяйственной биотехнологии» ФГБОУ

ВО Орловский ГАУ, в лаборатории аналитических и регистрационных испытаний ФИЦ «Немчиновка».

Гидрокавитационное оборудование представляет собой корпус и выполненные в корпусе входной элемент, предназначенный для подсоединения к источнику жидкости повышенного давления <150 кгс/см2, а также входной цилиндрический канал, камера и диффузор, которые расположены соосно и последовательно по ходу жидкости и сообщены между собой. Диффузор подсоединен непосредственно к камере с образованием между смежными поверхностями диффузора и камеры острой кромки.

В работе изучали зависимость концентрации редуцирующих веществ, полученных из растительного сырья, имеющий в своем составе целлюлозный комплекс и являющимися отходами сельскохозяйственного производства - шелуха рисовая, подсолнечника, гречихи; соломы злаковых культур; опилки хвойных пород, зерно пшеницы, свекловичный жом за счет гидрокавитационной обработки растительного материала, подготовленного при разных условиях измельчения (мелкий помол ≤0,5 мм и средний помол ≤1,0мм). Субстраты перед гидрокавитационной обработкой смешивали с водой - гидромодуль (1:36).

Ферментативный гидролиз проводили по общепринятым условиям - 10% (масс.) суспензия гидролизата (стандартный), температура инкубации - 50 °С, рН реакционной смеси - 5,5±0,8, время ферментативного гидролиза - 120 мин-1, перемешивание реакционной смеси - 120 об/мин.

Выход сахаров после гидролиза в гидрокавита-ционном устройстве и ферментолиза коммерческим ферментным препаратом ЦеллоЛюкс-F (ЦлА - 2000 ед./гр.) оценивали по показателям содержания в гидролизатах, ферментолизатах РВ (редуцирующих веществ).

Получение кормовых дрожжей на основе фер-ментолизатов соломы злаковых культур включает в себя подготовку в дрожжанке посевного материала дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365, подготовку среды и воздуха, установление рабочих параметров процесса ферментации, ферментацию.

Первоначально посев культуры S. cerevisiae ВКПМ Y-365 проводили в пробирки на скошенный агар (согласно паспорта микроорганизма), и инкубировали 48 часов, при температуре 35±2°С. Затем выращивание продолжали в колбах объемом 250 мл, в которые заливали по 100 мл питательной среды, в течение 16-18 часов, при температуре 35±2°С.

Затем дрожжи переносили в лабораторный аппарат вместимостью до 1,5 л, снабженный барботером для подачи воздуха. В процессе выращивания вносили в питательную среду отфильтрованную жидкую фазу ферментолизата с содержанием редуцирующих веществ (РВ) 1,5% (согласно потребности сахаромицета на синтез целевого белка) из расчета 0,75 л до 3 л питательной среды Ферментацию проводили в лабораторных условиях в биологическом реакторе -ферментере Minifors ( v 3 л ).

Режим культивирования сахаромицета:

• -    продолжительность ферментации 36 часов;

• -    частота оборотов мешалки - 120 мин-1.

• -    температура 38°С;

• -    рН 7,4 const.

После культивирования механически отделяли целевой продукт от среды, высушивали до 13% влажности, взвешивали и проводили определение «сырого» протеина по Кьельдалю (ГОСТ Р 53951-2010).

Исследования проводили в трёхкратной повторности и в трёх сериях экспериментов. Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы Microsoft Office Excell 10. Данные в таблицах – среднее значение ± стандартное отклонение.

Результаты исследований и их обсуждение. Лигноцеллюлозные комплексы, в форме которых находится целлюлоза в растениях, являются малодо- ступными для микроорганизмов. Поэтому для проведения микробной биоконверсии целлюлозосодержащих отходов производства в кормовой белок необходимым условием эффективного гидролиза ферментами в легкоусвояемые сбраживаемые сахара является предварительная обработка субстрата с целью разрушения кристаллической структуры полимерного комплекса и увеличения поверхности для доступности действия целлюлаз.

На диаграмме показан выход РВ (редуцирующих веществ) после гидрокавитационной обработки исследуемого лигноцеллюлозного сырья, подготовленного при разных условиях измельчения (рисунок 1).

подстилка органическая от животных вегетативная масса мискантуса свекловичный жом зерно пшеницы солома гречихи солома пшеницы шелуха подсолнечниковая шелуха рисовая шелуха гречишная опилки хвойных пород

Рис. 1 – Содержание РВ (%) в гидролизатах после гидрокавитационной обработки лигноцеллюлозного сырья, подготовленного при разных условиях измельчения

Во всех исследуемых субстратах, эффективнее процесс гидролиза проходит на сырье измельчением ≤0,5 (мелкий помол). После физической обработки сырья максимальное содержание РВ было получено в рисовой шелухе - 3,48%, в соломе пшеницы - 3,41%, в зерне пшеницы - 3,13%. В среднем показатель деструкции лигноцеллюлозного сырья, в зависимости от его помола, коррелирует в пределах 3,8-15,2%.

Не смотря на то, что наиболее эффективным считается процесс деструкции при помощи кислот, содержание РВ после гидрокавитационной обработки без использования кислотных реагентов является достаточным. Показано, что из целлюлозы была удалена часть нецеллюлозных компонентов.

Полученной концентрации сахаров недостаточно для биоконверсии в кормовой белок микробиологическим синтезом, что дает основание рассмотреть возможность использования ферментативного гидролиза сырья с использованием коммерческих препаратов целлюлаз. Ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих отходов приводит к значительному накоплению редуцирующих веществ (РВ).

Результаты ферментативного гидролиза исследуемых гидролизатов после гидрокавитационной обработки сырья, подготовленного при разных условиях измельчения, представлены на рисунке 2.

Рис. 2- Содержание РВ (%) в ферментолизатах, предобработанных гидрокавитационной обработкой лигноцеллюлозного сырья, подготовленного при разных условиях измельчения

В результате ферментатинвого гидролиза исследуемого сырья, предварительно обработанного гидродинамической кавитацией, показана та же зависимость, что и при самой физической обработке. Высокое содержание РВ в ферментолизатах обусловлено высоким содержанием органических компонентов в данных видах сырья.

Наибольший эффект от ферментативного гидролиза достигается в эксперименте с фракцией сырья ≤1 мм (средний помол), предварительно обработанном гидродинамической кавитацией. Выход РВ составил сырья опилок хвойных пород - 19,67%, шелухи рисовой - 15,58%, шелухи подсолнечника - 20,69%, подстилки органической от сельскохозяйственных животных - 18,98%, соломы пшеницы - 17,56%, соломы гречихи - 15,98%. Полученной концентрации сахаров достаточно для культивирования микробного продуцента белка штамма S. cerevisiae ВКПМ Y-365.

Результаты определения выхода кормовых дрожжей (в гр.) и % сырого протеина из ферментоли-затов на основе исследуемого сырья представлены на рисунке 3.

Рис. 3 - Выход кормового белка (в гр) при использовании предобработанного гидрокавитационной обработкой лигноцеллюлозного сырья, подготовленного при разных условиях измельчения

В среднем выход кормового белка в исследуемых предобработанных гидрокавитацией субстратов составил 21-38 гр. на 100 гр. сухого субстрата при использовании сырья с измельчением ≤1 мм (мелкий помол), тогда как механически измельчение до ≤1 мм (средний помол) – 19-22%.

Лигноцеллюлозное сырье после предобработки исследуемым физическим методом и дальнейшем подстилка органическая от животных вегетативная масса мискантуса свекловичный жом зерно пшеницы солома гречихи солома пшеницы шелуха подсолнечниковая шелуха рисовая шелуха гречишная опилки хвойных пород ферментативным гидролизом имеет в своем составе непрогидролизованную часть, которую удаляют из технологического процесса как отход.

Полученные кормовые белки имеют следующие содержания «сырого» протеина (%) при использовании разного рода сырья, измельченного до ≤0,5 мм – 34-46%, а до ≤1 мм – 31-39% (рисунок 4).

Рис. 4 - Выход массовой доли «сырого» протеина (%) при использовании предобработанного гид- рокавитацией лигноцеллюлозного сырья

Согласно ГОСТ 20083-74 «Дрожжи кормовые. Технические условия», полученные продукты соответствуют ГОСТ и относятся ко 2ой и 3-ей группе кормовых дрожжей. Максимальное содержание «сырого» протеина – 39-46% накоплено при использовании соломы злаковых культур. При использовании этих субстратов необходимо подготовить сырья измельчением ≤0,5 мм.

Таким образом, в нашем исследовании показано, что проведение гидродинамической кавитационной обработки лигноцеллюлозного сырья значительно повышает потенциал данного рода субстрата в процессах биоконверсии в ценные продукты, в частности, в кормовой микробиологический белок. Данный вид физического воздействия обеспечивает биодоступность органических компонентов субстратов к действию ферментов и, соответственно, к выходу легкоусвояемых дрожжами сбраживаемых сахаров.

Выводы. Установлено, что оптимальным сырьем для проведения физической гидродинамической кавитационной обработки лигноцеллюлозного сырья, являющимися отходами производств, по выходу сбраживаемых сахаров является солома злаковых культур. Оптимальные условия физической деструк- ции - измельчение сырья ≤0,5 мм (мелкий помол), использование гидрокавитационного оборудования, подсоединённого к источнику жидкости повышенного давления ≤150 кгс/см2.

Экспериментально обоснованы оптимальные технологические параметры ферментативного гидролиза исследуемых гидролизатов: 10% (масс.) суспензия гидролизата, концентрация ЦеллоЛюкс-F 0,5% (масс.), рН 4,5, t-50оС, продолжительность 120 мин., перемешивание реакционной смеси - 120 об./мин. Получены ферментолизаты с содержанием редуцирующих веществ до 15,9%.

Получены кормовые дрожжевые белки на основе ферментолизатов соломы злаковых культур с содержанием «сырого» протеина 43-46%.

Полученные экспериментальные данные убедительно свидетельствуют о целесообразности применения гидродинамической кавитационной обработки лигноцеллюлозного сырья для переработку в кормовой микробиологический белок. Данный метод может быть рекомендован для применения на биотехнологических предприятиях при подготовке растительных отходов к биоконверсии в ценные продукты.