Образование свободных аминокислот в дрожжах Saccharomyces cerevisiae Y-503 в процессе биосинтеза этанола

Котенко Светлана Цалистиновна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Исламмагомедова Эльвира Ахмедовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Объектами исследования являлись: штамм S.cerevisiae Y-503 (а.с. СССР № 1284998), который хранится в коллекции дрожжей Прикаспийского института биологических ресурсов Дагестанского научного центра РАН и геотермальная вода фенольного класса из скважины №7-Т Кизлярского месторождения. Подземная вода характеризуется как низкоминерализованная, гидрокарбонатно-хлоридная натриевая следующего состава (г/л): аммоний – 0,0015, натрий – 0,6211, калий – 0,0129, магний – 0,0033, кальций – 0,0092, стронций – 0,0003, железо – 0,0009, марганец – 0,000207, цинк – 0,000044, медь – 0,000014, никель – 0,000001, фтор – 0,0005, хлор – 0,4487, бром – 0,0030, йод – 0,0009, сульфат – 0,0905, гидрокарбонат – 0,8059, гидрофосфат – 0,000019, борная – 0,0135 и кремниевая – 0,0726 кислоты; содержит органические компоненты, в том числе (мг/л): битумы нейтральные – 2,0, битумы кислые – 1,4, гумусовые вещества – 4,6, фенолы – 0,54. Для культивирования дрожжей применялась мелассные питательные среды с использованием геотермальной воды фенольного класса (МПСГВ) и по традиционной технологии (МПС) [5].

Результаты настоящего эксперимента показали, что ресурсы углеводного питания штаммом S.сerevisiae Y-503 на МПС с геотермальной водой фенольного класса были востребованы на 96,3%, в то время как на МПС – 89,5%. Несомненно, что наличие в геотермальной воде фенольного класса таких важных биологически активных веществ, необходимых для жизнедеятельности живых организмов, как K, Na, Mg, Ca, Fe, Mn, борная, кремниевая кислоты, органические вещества, в частности, гумусовые, являющиеся стимуляторами физиологобиохимических процессов и активаторами мембранных перестроек в живой клетке, создает благоприятные условия для интенсификации спиртового брожения с образованием более высокого содержания этилового спирта. Согласно этому, в сброженном субстрате на опытной среде наблюдалось более активное спиртовое брожение (на 16,7%) и, соответственно, повышенная скорость метаболических процессов в клетках.

В результате исследований качественного и количественного состава свободных аминокислот биомассы дрожжей S.сerevisiae Y-503 , выращенных на опытной (с геотермальной водой) и традиционной средах, идентифицировано по 22 свободной аминокислоты, в том числе 12 незаменимых (см. рис.). Вместе с тем, суммарное содержание фонда аминокислот опытной биомассы составляет 28,4 мг/г, что на 21% выше по сравнению с контролем. В обоих вариантах дрожжей обнаружены следы фосфоэтаноламина (ЕА) – соединения, влияющего на рост дрожжевой популяции, что вполне объяснимо показателями высокой биохимической активности дрожжей в процессе биосинтеза этанола. Так, к концу спиртового брожения общее содержание опытной дрожжевой популяции возросло, по сравнению с контролем, почти в 2,5 раза, что позволило более полно сбраживать сахара и синтезировать этанол [4].

Рис. Содержание свободных аминокислот в биомассе штамма S. cerevisiae Y-503 , культивируемого на питательных средах с геотермальной водой фенольного класса (опыт) и традиционной (контроль)

Рассмотрим накопление отдельных аминокислот в обоих вариантах дрожжей. Так, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, аланин, пролин, треонин, аргинин, глутамин, серин оказывают максимально протекторное действие на белково-липидные компоненты клеток. Содержание в дрожжевой биомассе глутамина, проявляющего специфические коферментные функции, идентично как в опыте, так и в контроле. Вместе с тем, остальные идентифицированные аминокислоты обнаружены в повышенном количестве в опытном варианте. Образование глутаминовой и аспарагиновой кислот, аланина обычно на порядок выше, чем других аминокислот. Фактически эти аминокислоты вовлекают в метаболизм клеток почти весь азот, что обуславливает поддержание азотистого баланса живых организмов. Многообразие функций определило их высокую концентрацию в клетке. Обнаружена интересная особенность – независимо от состава питательной среды содержание указанных кислот в аминокислотном пуле всегда значительное [2], причем в наших исследованиях составляет 40%. Очевидна их регуляторная роль, которая проявляется в сопряжении путей метаболизма азотсодержащих соединений, передающих азот аминных и амидных групп для синтеза аминокислот, аминосахаров, нуклеотидов, азотсодержащих липидов. Именно глутаминовая и аспарагиновая кислоты сопрягают анаэробный энергетический метаболизм, перенося в челночных механизмах атомы водорода из цитоплазмы в митохондрии. Показано, что содержание глутаминовой и аспарагиновой кислот, имеющих фундаментальное значение в биосинтезе всех аминокислот и формировании комплексов металлозависимых ферментов у микроорганизмов, в опыте составляло по 3,9 мг/100 г, что на 18,2% выше по сравнению с контролем. Аланин (2,8:2,7 мг/100 г, МПСГВ:МПС) является составной частью витамина – пантотеновой кислоты, оказывает наибольший протекторный эффект на клеточные мембраны. Серин (1,5:1,3 мг/100 г, МПСГВ: МПС) тесно связан с обменом пировиноградной кислоты и из него, как из аланина, могут синтезироваться углеводы. Известна роль глицина (1,2:0,9 мг/100 г, МПСГВ: МПС) в качестве конформационного «шарнира» в формировании и подвижности активного центра ферментов при синтезе заменимых аминокислот. Пролин (0,9:0,6 мг/100 г, МПСГВ: МПС) – важнейший белковый строительный материал клетки, действующий как аллостерический ингибитор. Накопление орнитина (0,1:0,1 мг/100 г, МПСГВ: МПС), участвующего в обезвреживании избыточного количества аммиака, поступающего в организм, идентично в обоих вариантах.

Вместе с тем содержание незаменимых аминокислот составляло 13,3 мг/100 г, в то время как в контроле на 26,7% ниже. Обнаружено, что накопление всех незаменимых аминокислот в опытном варианте несколько выше, кроме цистеина. Причем наибольшее их количество в опыте приходится на валин, лейцин, изолейцин, тирозин, лизин (1,8:1,3, 1,8:1,4, 1,6:1,2, 1,4:1,1, 1,4:0,9 мг/100 г, МПСГВ:МПС). Валин, лейцин и изолейцин, действующие совместно в химических реакциях, входящие в комплекс ВСАА (от англ.branched chain amino) клетки, в обоих вариантах дрожжей составляют около 54% от общего содержания незаменимых аминокислот. Они участвуют в регуляции калиевого обмена, выполняют важнейшие биохимические функции в метаболизме углеводов, необходимые для протекания активного спиртового брожения. Изолейцин, лейцин осуществляют важную роль в процессе деления дрожжевых клеток, вызывая усиление гликогенеза. Лизин является мощным источником энергии, ускоряя расщепление липидов. Оксилизин (1,5:1,6 мг/100 г, МПСГВ:МПС), оксипроизводное лизина, единственная незаменимая кислота, содержание которой в опыте ниже на 6%. Остальные незаменимые аминокислоты играют не менее важную роль в метаболизме дрожжевых клеток. Гистидин – суперкатализатор (0,3:0,2 мг/100 г, МПСГВ:МПС), входящий в активные центры гормонов и большого числа ферментов, регулирующих защитные функции организма. В присутствии фенилаланина (1,0:0,8 мг/100 г, МПСГВ:МПС) и тирозина (1,4:1,1 мг/100 г, МПСГВ:МПС) происходит значительное усиление метаболизма клеток и резкий функционально-морфологический эффект. Обнаруженный вдвое больше в опытных дрожжах метионин (0,2:0,1 мг/100 г, МПСГВ:МПС) участвует в синтезе белка и формировании таких жизненно важных веществ, как холин и метилированные формы нуклеиновых кислот; и также, как треонин (1,0:0,9 мг/100 г, МПСГВ:МПС) значительно увеличивает количество выделяющегося глюта-тиона. Содержание цистеина (0,1:0,1 мг/100 г, МПСГВ:МПС) идентично в обоих вариантах. Цистеин и метионин, как серасодержащие аминокислоты, являются антиоксидантами, обладают протекторными свойствами. Особая роль указанных аминокислот в обмене веществ связана с тем, что они участвуют в биосинтезе большого числа биологически активных веществ. Широкий спектр регуляторного влияния аргинина (0,9:0,7 мг/100 г, МПСГВ: МПС) на обмен веществ сопряжен с необходимостью поддержания его в определенной концентрации в организме. Высокая реакционная способность аргинина определила его важную роль в активации ряда ферментов и адаптации дрожжевой клетки к экстремальным условиям, детоксикации вредных веществ. Триптофан (0,3:0,2 мг/100 г, МПСГВ: МПС) стимулирует выработку гормонов роста и витаминов группы В. Следует отметить, что содержание триптофана, аргинина, аспарагиновой кислоты, серина, треонина и аланина, значительно активирующих спиртовое брожение (относящихся к фактору Z), выше в опытном варианте на 50,0%, 28,6%, 18,2%, 15,4%, 11,1% и 3,7% соответственно. Можно предположить, что высокое содержание свободных аминокислот способствует физиолого-биохимической активности опытного штамма дрожжей S. cerevisiae Y-503, участвующего в процессе синтеза этанола [4].

Выводы: дрожжи Saccharomyces cerevisiae Y-503 , выращенные на мелассной питательной среде с геотермальной водой фенольного класса, накапливают больше свободных аминокислот, чем полученные по традиционной технологии, что позволяет в большей мере интенсифицировать процесс спиртового брожения.

Работа выполнена в рамках гранта РФФИ № 09 – 05 – 96514 « Новый биологически активный стимулятор для интенсификации синтеза этанола в интересах агропромышленного комплекса на основе использования геотермальных ресурсов Дагестана » регионального конкурса « Юг России ».